Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kırmızı Deniz Yosunu Gracilaria gracilis'in Biyorafineri Yaklaşımı ile Değerlendirilmesi

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Summary

Burada, Gracilaria gracilis'in entegre bir şekilde değerlendirilmesini amaçlayan birkaç protokolü açıklıyoruz: yabani türlerin toplanması, kurum içi büyüme ve biyoaktif bileşenlerin ekstraksiyonu. Ekstraktların antioksidan, antimikrobiyal ve sitotoksik etkileri, bütün deniz yosunu biyokütlesi ve pigmentleri ile zenginleştirilmiş gıdaların beslenme ve stabilite değerlendirmesi ile birlikte değerlendirilir.

Abstract

Değerli ve çok hedefli biyoaktif bileşenler elde etmek için bol miktarda hammadde olarak deniz yosunlarına olan ilgi sürekli artmaktadır. Bu çalışmada, kozmetik, farmakolojik, gıda ve yem uygulamaları için bir agar ve diğer bileşenlerin kaynağı olarak ticari çıkarları nedeniyle dünya çapında yetiştirilen yenilebilir bir kırmızı deniz yosunu olan Gracilaria gracilis'in potansiyelini araştırıyoruz.

G. gracilis büyüme koşulları, büyük bir biyokütle stoğu elde etmek için fizikokimyasal koşulları manipüle ederken vejetatif çoğaltma ve sporülasyon yoluyla optimize edildi. Deniz yosunu biyokütlesi üzerinde etanol ve su ile yeşil ekstraksiyon metodolojileri gerçekleştirildi. Ekstraktların biyoaktif potansiyeli, sitotoksisiteleri, antioksidanları ve antimikrobiyal özellikleri ile ilgili bir dizi in vitro test ile değerlendirildi. Ek olarak, kurutulmuş deniz yosunu biyokütlesi, gıdanın besin değerini artırmak için makarna formülasyonlarına dahil edildi. G. gracilis'ten ekstrakte edilen pigmentler de doğal bir renklendirici olarak yoğurda dahil edilmiş ve stabiliteleri değerlendirilmiştir. Her iki ürün de pazara ulaşmadan önce en iyi nihai formülasyonu elde etmeyi amaçlayan yarı eğitimli bir duyusal panelin takdirine sunuldu.

Sonuçlar, G. gracilis'in bütün bir biyokütle, ekstrakt ve/veya pigment olarak uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın çok yönlülüğünü desteklemektedir. Bu çalışma, birkaç optimize edilmiş protokolün uygulanmasıyla, gıda, kozmetik ve su ürünleri pazarlarından kâr etme potansiyeline sahip ürünlerin geliştirilmesine olanak tanıyarak çevresel sürdürülebilirliği ve mavi döngüsel ekonomiyi teşvik eder.

Ayrıca, bir biyorafineri yaklaşımına uygun olarak, artık deniz yosunu biyokütlesi, bitki büyümesi için biyostimülan olarak kullanılacak veya Leiria, Portekiz'deki MARE-Polytechnic'in kurum içi su ürünleri yetiştiriciliği sistemlerinin su arıtmasında kullanılmak üzere karbon malzemelerine dönüştürülecektir.

Introduction

Deniz yosunları, ilaç, gıda, yem ve çevre sektörleri tarafından yararlanılacak ilginç bir doğal hammadde olarak kabul edilebilir. Birçoğu karasal organizmalarda bulunmayan ve ilgili biyolojik özelliklere sahip bir dizi molekülü biyosentezlerler 1,2. Bununla birlikte, büyük bir biyokütle stoğu sağlamak için deniz yosunu için optimize edilmiş yetiştirme protokollerinin uygulanması gerekir.

Yetiştirme yöntemleri her zaman deniz yosunu thalli'nin doğasını ve genel morfolojisini dikkate almalıdır. Gracilaria gracilis klonal bir taksondur, yani bağlanma organı birden fazla vejetatif eksen üretir. Parçalanma (vejetatif üreme) yoluyla çoğaltma böylece elde edilir, çünkü bu eksenlerin her biri ana thallus3'ten bağımsız bir yaşamı tamamen benimseyebilir. Klonal taksonlar, basit ve hızlı tek adımlı yetiştirme metodolojileriyle başarılı bir şekilde entegre edilebilir, çünkü büyük miktarlarda biyokütle, thallusun hızla yenilenen ve yeni, genetik olarak özdeş bireylere dönüşen küçük parçalara bölünmesiyle elde edilir. Bu süreçte hem haplontik hem de diplontik thalli kullanılabilir. Cins, karmaşık bir haplo-diplontik izomorfik trifazik yaşam döngüsü sergilemesine rağmen, gelişmiş mahsuller elde etmek için stokların genetik yenilenmesinin gerekli olduğu durumlar dışında, sporülasyon nadiren gereklidir. Bu durumda, hem tetrasporlar (mayoz bölünme tarafından oluşturulan haplontik sporlar) hem de karposporlar (mitoz tarafından oluşturulan diplontik sporlar), daha sonra vejetatif üreme ile yetiştirilebilen ve çoğaltılabilen makroskopik thallilere yol açar4. Büyüme döngüleri, epifitlerin ortaya çıkması ve diğer organizmaların yapışması gibi diğer biyolojik faktörlerin yanı sıra çevresel koşullar ve bireylerin fizyolojik durumu tarafından belirlenir. Bu nedenle, yüksek verimlilik sağlamak ve kaliteli biyokütle üretmek için yetiştirme koşullarını optimize etmek çok önemlidir5.

G. gracilis de dahil olmak üzere deniz yosunundan biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu çeşitli yöntemlerle gerçekleştirilebilir 6,7. Ekstraksiyon yönteminin seçimi, ilgilenilen spesifik bileşiklere, hedef uygulamaya ve deniz yosununun özelliklerine bağlıdır. Bu çalışmada, deniz yosunu biyokütlesinden biyoaktif bileşikleri çözmek ve çıkarmak için su veya etanol gibi yeşil çözücülerin kullanılmasını içeren çözücü ekstraksiyonuna odaklandık. Ekstraksiyon, maserasyon yoluyla çok yönlü ve etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir ve çok çeşitli bileşikler için kullanılabilir. Biyokütlenin bir çözücü içinde uzun bir süre, tipik olarak oda veya biraz yüksek sıcaklıklarda bekletilmesini içeren basit ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ekstraksiyon işlemini geliştirmek için çözücü karıştırılır. İstenilen ekstraksiyon süresinden sonra çözücü, filtrasyon veya santrifüjleme ile katı malzemeden ayrılır.

Su, güvenliği, bulunabilirliği ve çok çeşitli gıda ürünleriyle uyumluluğu nedeniyle gıda uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir çözücüdür. Su ekstraksiyonu, polisakkaritler, peptitler ve bazı fenolikler gibi polar bileşikler için uygundur. Bununla birlikte, polar olmayan bileşikleri etkili bir şekilde çıkaramayabilir. Etanol ayrıca gıda uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir çözücüdür ve fenolik bileşikler, flavonoidler ve belirli pigmentler dahil olmak üzere çeşitli biyoaktif moleküllerin ekstraksiyonunda etkili olabilir. Etanol genellikle gıdalarda kullanım için güvenli olarak kabul edilir ve ekstrakte edilen bileşikleri geride bırakarak kolayca buharlaştırılabilir. Ekstraksiyon yöntemi seçiminin verimlilik, seçicilik, maliyet etkinliği ve çevresel etki gibi faktörleri dikkate alması gerektiğini belirtmekte fayda var. Çözücü konsantrasyonu, ekstraksiyon süresi, sıcaklık ve basınç gibi ekstraksiyon parametrelerinin optimizasyonu, G. gracilis veya diğer deniz yosunlarından biyoaktif bileşiklerin optimum verimini elde etmek için çok önemlidir.

Deniz yosunlarının bakteriler, mantarlar ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivite sergilediği bulunmuştur8. Bu aktivite, fenolikler, polisakkaritler, peptitler ve yağ asitleri dahil olmak üzere biyoaktif bileşenlere atfedilir. Çeşitli çalışmalar, diğerlerinin yanı sıra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. ve Pseudomonas aeruginosa gibi patojenlere karşı etkinliklerini göstermiştir9. Deniz yosunlarının antimikrobiyal aktivitesi, mikrobiyal hücre duvarlarına, zarlara, enzimlere ve sinyal yollarına müdahale edebilen biyoaktif bileşiklerin varlığına atfedilir10. Bu bileşikler mikrobiyal büyümeyi bozabilir, biyofilm oluşumunu engelleyebilir ve bağışıklık tepkilerini modüle edebilir.

Ormangülü olarak da bilinen kırmızı deniz yosunları, çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivite gösterebilen bir alg grubudur. Bu grup içinde, G. gracilis , bildirilen antimikrobiyal aktivitesine katkıda bulunabilecek çeşitli biyoaktif bileşikler içerir. Spesifik moleküller değişebilse de, G. gracilis'te bildirilen ve antimikrobiyal özelliklere sahip olabilen ortak sınıflar polisakkaritler, fenolikler, terpenoidler ve pigmentlerdir11. Bununla birlikte, bu bileşenlerin varlığının ve miktarlarının deniz yosununun toplandığı yer, mevsimsellik, talinin fizyolojik durumu ve çevresel koşullar gibi faktörlere bağlı olarak değişebileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, G. gracilis'teki antimikrobiyal bileşiklerin spesifik sınıfı ve konsantrasyonu buna göre değişebilir.

G. gracilis'in ayrıca serbest radikalleri temizlediği ve oksidatif stresi azalttığı gösterilen çeşitli fenolik bileşikler içeren antioksidan özelliklere sahip olduğu bulunmuştur12.Antioksidanlar, hücreleri reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hasarlardan korumaya yardımcı olur ve potansiyel sağlık yararları vardır. Antioksidan kapasite, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) serbest radikal süpürücü aktivitesi dahil olmak üzere farklı yöntemlerle doğrudan ve dolaylı olarak toplam polifenolik içeriğin (TPC) miktarının belirlenmesi yoluyla değerlendirilebilir13.

Bir bileşenin belirgin bir biyoaktiviteye sahip olduğu bildirilse de, sitotoksisite değerlendirmesi, canlı hücreler veya dokularla temas halinde kullanılacak doğal ve sentetik maddelerin değerlendirilmesinde vazgeçilmezdir. Sitotoksisiteyi ölçmek için her biri avantajları ve sınırlamaları olan birkaç yöntem vardır. Genel olarak, birçok maddenin hücreler üzerindeki zararlı etkilerini değerlendirmek ve aynı zamanda hücre hasarı ve ölüm mekanizmalarını araştırmak için bir dizi seçenek sunarlar14.

Bu çalışmada, Mosmann (1983)15 tarafından tanıtılan kolorimetrik bir yöntem olan 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testini kullanıyoruz. Bu yöntem, tetrazolyum tuzlarının metabolik olarak aktif hücreler tarafından mor bir formazan ürününe indirgenmesini ölçer. Formazan kristallerinin miktarı ne kadar yüksek olursa, canlı hücrelerin sayısı da o kadar yüksek olur, böylece dolaylı bir sitotoksisiteölçüsü sağlanır 14. Bu çalışmada, G. gracilis su ve etanol ekstraktlarının dermo-kozmetik formülasyonlara dahil edilmesi amaçlandığından, in vitro sitotoksisite değerlendirmesi bir keratinosit (HaCaT) hücre hattında gerçekleştirilir.

Gıda uygulamasıyla ilgili olarak, deniz yosunları genellikle kalorileri düşüktür ve diyet lifleri, esansiyel elementler ve amino asitler, polisakkaritler, çoklu doymamış yağ asitleri, polifenoller ve vitaminleraçısından besleyici açıdan zengindir 2,16. G. gracilis, ilginç bir besin değerine sahip bir istisna değildir. Freitas ve ark. (2021)4, ekili G. gracilis'in yabani deniz yosununa kıyasla daha yüksek protein ve C vitamini seviyelerine sahip olduğunu ve toplam lipit seviyesini koruduğunu buldu. Bu, ekonomik ve çevresel bir avantajı temsil edebilir, çünkü beslenme açısından konuşursak, üretim vahşi kaynakların sömürülmesine tercih edilir. Buna ek olarak, tüketiciler yedikleri yiyeceklerin türü hakkında giderek daha fazla endişe duyuyorlar, bu nedenle gıda zenginleştirme için yeni bileşenler sunmak ve bir ürüne değer katabilecek ve "temiz bir etiket" talep edebilecek özler elde etmek için yeni kaynaklar kullanmak önemlidir. Ayrıca, mevcut pazar çok rekabetçidir ve üreticileri rakiplerinden farklılaştırmak için yeni ürünlerin ve yenilikçi stratejilerin geliştirilmesini gerektirir17.

Makarna gibi besin değeri düşük olan ürünlerin deniz yosunu da dahil olmak üzere deniz kaynakları ile zenginleştirilmesi, bu kaynağın yeni bir gıda olarak tanıtılması ve farklı besin değerine sahip bir ürün aracılığıyla pazarda farklılaşma stratejisidir. Öte yandan, G. gracilis , gıda endüstrisindeki uygulamalar için yüksek potansiyele sahip, ficobiliproteinler18 gibi doğal kırmızı pigmentlerin kaynağıdır. Bu deniz yosunu birçok alanda büyük ilgi görmüştür ve uygulaması tüm deniz yosunu, özler ve/veya kalan biyokütle kullanılarak yapılabilir. Bu çalışmada, bu tür uygulamaların bazı örneklerini gösteriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Biyokütle hasadı ve hazırlanması

  1. Düşük gelgit sırasında G. gracilis örneklerini hasat edin ve kuruma, ışığa ve havaya maruz kalmayı önlemek için bunları karanlık, soğutulmuş kutularda hızlı bir şekilde laboratuvara taşıyın.
  2. Laboratuvarda, her bir thallusu akan deniz suyuyla yıkayın ve yüzeydeki kalıntıları, nekrotik parçaları, epifitleri ve diğer organizmaları temizlemek için iyice temizleyin.
  3. Yabani biyokütleyi sürekli havalandırılan deniz suyunda (31-35 psu) gün ışığı, soğuk beyaz ± flüoresan lambalar ve 7 gün boyunca 16:08'de (açık: karanlık) fotoperiyot ile sağlanan düşük ışınımlı bir iklim odasında (20 1 °C) tutun. Bu süre zarfında, herhangi bir besin ortamı sağlamayın; Bu, deniz yosununun yeni iç mekan koşullarına yavaş yavaş uyum sağlamasını sağlar.

2. Stok bakımı

  1. İklimlendirme dönemini takiben, steril bir bıçakla deniz yosunu thalli'nin sağlıklı uçlarını kesin. Redmond ve ark. (2014)19 ve steril koşullar altında, kalan kirleticileri gidermek için her bir ucu daha önce Petri kaplarında (%1,0 bakteriyolojik agar, 1:1 damıtılmış su/deniz suyu oranında) hazırlanmış bir agar jeli boyunca sürükleyin. Her uç için agar sürüklemesini üç kez gerçekleştirin ve ucu her zaman agar jelinin kullanılmayan kısımlarından sürükleyin.
  2. Asitle cam eşyaları bir hidroklorik asit çözeltisinde (HCl,% 15) yıkayın ve damıtılmış suyla iyice durulayın. Temizleme işleminde kullanılan tüm aletleri, cam eşyaları, agarı, deniz suyunu ve damıtılmış suyu otoklavda (121 °C, 15 dakika) sterilize edin.
    DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan HCl'nin güvenlik bilgi formuna bakın.
  3. Redmond ve ark. (2014)19'a göre, kırmızı deniz yosunları için modifiye edilmiş Von Stosch Zenginleştirilmiş çözelti (VSE) ile desteklenmiş 35 psu'da sterilize deniz suyunda büyür. Epifitik diatomların büyümesini önlemek için ortama (1 mL/L) germanyum dioksit (GeO2) ekleyin.
    DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan GeO2'nin güvenlik veri sayfasına bakın.
    NOT: Kısmi veya tam renk değişikliği ile gözlemlendiği gibi pigmentasyon kaybı gösteren uçlar stres altındadır veya zaten ölmüştür ve atılmalıdır.

3. Yetiştirme ve ölçek büyütme

  1. İklimlendirme periyodundan sonra, 20 ± 0,5 μmol fotonlar m-2 s-1 (1500 lüks) beyaz soğuk ışık, 16 saat: 8 saat (açık: koyu) olarak ayarlanmış bir fotoperiyot ve her hafta yenilenen VSE kültür ortamı ile zenginleştirilmiş steril deniz suyu ile 20 ± 1 °C'ye ayarlanmış bir iklim odasında yaklaşık 8-10 sağlıklı ucu 250 mL düz tabanlı şişelere rastgele dağıtın.
  2. Haftalık ağırlık ölçümleri yapın, thallusu aşırı zorlamaktan kaçının20. Bunun için, uçları kültür ortamından dikkatlice çıkarın, hafifçe durulayın ve miligramları bir laboratuvar ölçeğinde tartın.
    NOT: Bu prosedür, kültür ortamının haftalık yenilenmesi ile birlikte gerçekleştirilebilir.
  3. Thalli bu şişelerde 2 g/L yoğunluğa kadar büyüyebilir. Bu noktada, bir alıcı ölçeği büyütme (250 mL, 1 L ve 5 L) gerçekleştirin. Hacim 5 L'ye ulaştığında ekimi 50 L ve daha büyük dış mekan açık beyaz kaplara aktarın.
  4. Patarra ve ark. (2017)21'e göre nispi büyüme oranını (RGR) hesaplayın:
    RGR (% fw/gün) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    burada iw ve fw, sırasıyla gram cinsinden ifade edilen ilk ve son taze ağırlıktır ve t, gün cinsinden zamandır.
    NOT: Bu laboratuvar kurulumunda RGR günde %21'e varan değerlere ulaşmaktadır. Biyokütle hasadı herhangi bir zamanda yapılabilir. Biyokütle, kullanım amacına bağlı olarak fırında kurutma, dondurarak kurutma veya sadece donmuş (-20 °C) olarak depolanarak bozulmayı önlemek için hızlı bir şekilde işlenmelidir. Kurutulmuş biyokütle oda sıcaklığında (RT) korunabilir veya donmuş olarak da saklanabilir.

4. Ekstraksiyon prosedürü

NOT: G. gracils ekstraktlarının in vitro sitotoksisitesini, antioksidan ve antimikrobiyal özelliklerini değerlendirmek için hazırlanması iki farklı parametreyi dikkate alır: ekstraksiyon sıcaklığı ve çözücü tipi.

  1. Ekstraksiyonları gerçekleştirmek için, G. gracilis biyokütlesini fırında kurutun ve toz 200 μm'lik bir elekten geçene kadar biyokütleyi (örneğin bir ev tipi kahve değirmeninde) öğütün.
  2. Kurutulmuş biyokütleyi (10 g) tartın ve 100 mL çözücü (mutlak etanol veya steril su) içinde çözün.
  3. Işıktan korunan bir kapta 30 dakika karıştırın.
  4. RT, 40 °C ve 70 °C'de su ve su > etanol ekstraksiyonları > sıralı etanol gerçekleştirin.
  5. Her sıcaklık için, etanol ve su ile ekstraksiyonları iki kez ayrı ayrı gerçekleştirin.
  6. Sıvı ekstraktları kalan biyokütleden filtre kağıdından (Whatman No.1) süzülerek ayırın, ardından RT'de 10 dakika boyunca 8000 x g'da santrifüjleyin.
  7. Kalan alg biyokütlesini diğer çözücü ile daha fazla ekstraksiyon için yeniden kullanın. Bir numune ilk olarak etanol ile ekstrakte edildiyse, daha sonra su ile ekstrakte edin ve bunun tersi de geçerlidir.
  8. Sulu ekstraktları dondurarak kurutun ve etanol ekstraktlarını 40 °C'de döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırın.
  9. Kurutulmuş ekstraktları 4 °C'de saklayın.
  10. Ekstraktları 50 mg / mL (antimikrobiyal testler) veya 10 mg / mL (antioksidan deneyler) konsantrasyonda çözün. Sulu ekstraktları steril suda ve etanolik ekstraktları mutlak etanolde çözün.

5. Antimikrobiyal aktivite

NOT: Etanolik ve sulu ekstraktlar, Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) ve Listonella anguillarum'a (DSM 21597). Antimikrobiyal testler, Ulusal Klinik Laboratuvar Standartları Komitesi'nin (NCCLS, 2012)22 tavsiyelerine göre yapılmalıdır. Tüm kültürler Alman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan (DSMZ) elde edildi. L. anguillarum , %1 sodyum klorür (NaCl) ile desteklenmiş triptik soya suyu (TSB) veya triptik soya agar (TSA) üzerinde yetiştirildi. Kalan iki suş LB ortamında (VWR Chemicals) büyütüldü. Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) ve Listonella anguillarum (DSM 21597) kültürleri 30 °C'de inkübe edilirken, Escherichia coli (DSM 5922) tedarikçinin talimatlarına göre 37 °C'de inkübe edildi. Et suyu mikrodilüsyon yöntemi, sıvı bir ortamda antimikrobiyal aktivitenin belirlenmesi için kullanılabilir ve bu, antimikrobiyal potansiyelin hızlı ve verimli bir şekilde belirlenmesine izin verecek şekilde mikro ölçekte gerçekleştirilmelidir. Bu düşük maliyetli yöntem, sonuçların sadece 24 saat içinde elde edilmesini sağlar, bu nedenle, belirli bir mikrobiyal suş için büyüme inhibitör etki açısından sonuçların elde edilmesine izin veren en iyi ekstraksiyon koşullarının erken bir aşamada belirlenmesi için uygundur. Bununla birlikte, metodoloji, mikrobiyal büyümeye özgü bir kapaklı steril mikroplakaların kullanılmasını ve ayrıca 600 nm dalga boyu için bir mikroplaka okuyucunun bulunmasını gerektirir.

  1. Et suyu mikrodilüsyon testlerini, 10 μL standartlaştırılmış aşı (0.5 McFarland standardında) ve 20 μL her ekstrakt (50 mg / mL) ile aşılanmış 170 μL Muller-Hinton Et Suyu (MHB) ile işlenmemiş ve yuvarlak tabanlı 96 oyuklu mikroplakalar kullanarak gerçekleştirin.
  2. Plakaları her suş için en uygun sıcaklıkta 24 saat inkübe edin.
  3. Optik yoğunluğun (OD 600) 0 saat ve 24 saatte bir mikroplaka spektrofotometresine kaydedilmesiyle ölçülen görünür bulanıklığın azaltılmasıyla antimikrobiyal aktiviteyi tespit edin.
  4. Sonuçları inhibisyon yüzdesi olarak ifade edin:
    Equation 1
    burada Abs. ext, ekstrakt varlığında büyüyen bakteri suşu içeren kuyucuklarda 0 saat ile 24 saat arasında ölçülen absorbanstaki farktır ve Abs, bakteri suşu ve çözücü içeren kuyucuklarda aynı ölçüyü ifade eder.
  5. Bu yöntemde, negatif kontrol olacak sadece kültür ortamı içeren kuyucuklarla, aynı zamanda çözücüye eklenen standart suşla (etanol veya su) aşılanmış ortama ve bakteriyel suş ve pozitif kontrol antibiyotiğine sahip ortama sahip kuyucuklarla kontrol reaksiyonlarını içerir (kloramfenikol).

6. Antioksidan aktivite ve toplam polifenollerin miktar tayini

  1. Toplam polifenolik içerik
    NOT: Toplam polifenolik içerik (TPC), Folin-Ciocalteu yöntemi23 kullanılarak gerçekleştirilir ve mikro ölçeğe uyarlanır.
    1. Işıktan korunan 96 oyuklu bir mikroplakanın her bir kuyucuğuna 158 μL ultra saf su, 2 μL numune ve 10 μL Folin-Ciocalteu reaktifi ekleyin.
      DİKKAT: Tedarikçi tarafından teslim edilen Folin-Ciocalteu reaktifinin güvenlik veri sayfasına bakın.
    2. 2 dakika sonra 30 μLNa2CO3 (%20) ekleyin.
    3. RT'de karanlıkta 1 saat inkübasyondan sonra, numuneleri 755 nm'de spektrofotometrik olarak ölçün.
    4. Kontrol olarak gallik asit (kalibrasyon eğrisinin çizilmesine izin verir) veya ultra saf su (2 μL) kullanın.
    5. Sonuçları gallik asit eşdeğerleri (mg GAE/g ekstraktı) olarak ifade edin.
  2. 2,2 difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürücü aktivite
    NOT: Ekstraktların antioksidan aktivitesi, Duan ve ark. (2006)24, mikro ölçeğe uyarlanmıştır
    1. Işıktan korunan 96 oyuklu bir mikroplakaya, her numuneden 2 μL (10 mg/mL konsantrasyonda) ve mutlak etanol (0.1 mM) içinde çözülmüş 198 μL DPPH yerleştirin.
      DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan DPPH'nin güvenlik bilgi formuna bakın.
    2. Reaksiyonu karanlıkta RT'de 30 dakika çalıştırın. Bir mikroplaka spektrofotometresinde 517 nm'de absorbansı ölçün.
    3. 2 μL mutlak etanol/damıtılmış su ve 198 μL DPPH çözeltisi ile bir kontrol reaksiyonu gerçekleştirin. 2 μL ekstrakt ve 198 μL mutlak etanol ile boş bir ölçüm yapın.
    4. Aşağıdaki denklemi kullanarak sonuçları DPPH inhibisyonunun yüzdesi olarak ifade edin:
      Equation 2
      burada Alg ekstraktının absorbansı gibi, Ab boş numunelerin absorbansıdır ve Ac kontrolün absorbansıdır.

7. Epidermal hücrelerde sitotoksisite değerlendirmesi

NOT: G. gracilis'in sulu ve etanol ekstraktlarının in vitro sitotoksik etkisi, daha önce tarif edildiği gibi MTT kolorimetrik testi yoluyla insan keratinositlerinde (HaCaT hücreleri - 300493) değerlendirilir25. Hücreler Cell Lines Services, Almanya'dan (CLS) alındı ve yöntem kurumsal yönergelere ve CLS talimatlarına uygun olarak gerçekleştirildi.
DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan MTT'nin güvenlik bilgi formuna bakın)

  1. Hücre kültürü bakımı
    1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimikotik solüsyon (amfoterisin B, 0.25 mM; penisilin, 60 mM; streptomisin, 100 mM) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın yüksek glikoz ortamındaki (DMEM) HaCaT hücrelerini kültürleyin.
    2. Hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA kullanın.
      NOT: HaCaT hücrelerinin alt kültürü, hücreler toplam birleşmeye ulaştıktan sonra gerçekleştirilir.
    3. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 ve% 95 nem ile bir odada kültürleyin.
    4. Kültürler %80-85 birleşmeye ulaştığında hücreleri biyobanka talimatlarına göre alt kültürleyin.
  2. Sitotoksisite değerlendirmesi
    1. Hücreleri 96 oyuklu plakalara tohumladıktan ve gece boyunca inkübe ettikten sonra, HaCaT hücrelerini (4 x 104 hücre / kuyu) daha önce DMSO (100 mg / mL) içinde çözülmüş kurutulmuş ekstraktlarla tedavi edin. Daha sonra, 198 μL ortama 2 μL ekstrakt çözeltisi ekleyin ve plakaları 24 saat inkübe edin.
    2. Kültür ortamını çıkarın ve hücrelere 100 μL MTT (0.5 mg / mL) ekleyin. Hücreleri, yukarıda belirtilen normal kültür koşullarında karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
    3. MTT çözeltisini çıkarın ve hücre içi formazan kristallerini 100 μL DMSO ile çözündürün.
    4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 570 nm'de ölçün. Sonuçları, kontrol edilmemiş hücrelerin yüzdesi olarak ifade edin.

8. Gıda inovasyonu

  1. Yeni gıda ürünü: Deniz yosunlu makarna
    1. Malzemelerin seçimi ve makarna formülasyonu
      NOT: Malzeme seçimi bir makarna firması ile işbirliği içinde yapılmıştır. Temel bileşenlerin seçimi (bölüm 8.2'de açıklanmıştır), kolay erişilebilirlikleri ve mevcut üretim hatlarıyla uyumlulukları göz önünde bulundurularak, besin değeri eklenmiş makarna elde etmek için deniz kaynakları kullanılarak yapılmıştır.
      1. Bileşenlerin seçiminden sonra, formülasyonların teorik kimyasal bileşimini bir elektronik tablo kullanarak analiz ederek, amaçlanan besin değerine (lif kaynağı, vitaminler ve mineral elementler, düşük doymuş yağlar) göre formülasyonu tasarlayın.
      2. Teorik gereksinimler karşılandığında, adım 8.1.2'de açıklandığı gibi laboratuvar ölçeğinde üretime devam edin.
      3. Aşağıdaki adımlar için yeniden formülasyon ihtiyacını veya formülasyonun kabulünü doğrulamak için yarı eğitimli bir panel (>10 tadımcı) ile duyusal bir test gerçekleştirin.
        NOT: Panel daha önce makarna tadımı için eğitilmişti ve sunulan formülasyonları lezzet, tat, koku, doku ve görünüm gibi özelliklerle ilgili olarak hedonik olarak değerlendirdi.
    2. Makarna üretimi
      NOT: Bir makarna ekstrüderi kullanarak Chifferi makarna örnekleri üretin.
      1. Ekipmanda, önceden tanımlanmış pirinç unu, G. gracilis ve Chlorella vulgaris kısımlarını karıştırın ve karışıma yaklaşık% 30 su ekleyin.
      2. Kuru makarna elde etmek için, Chifferi'yi 68 °C'de 42 dakika, ardından 5 saat, 30 dakika 76 °C'de endüstriyel bir işlemi simüle ederek kurutun.
      3. Son olarak, numuneleri paketleyin ve vakumlayın ve daha fazla analize kadar RT'de karanlık bir yerde saklayın.
    3. Beslenme analizi
      NOT: Beslenme profili analizleri için kurutulmuş ve yumuşatılmış numuneleri üç nüsha halinde kullanın.
      1. Ham protein içeriği: Duarte ve ark. (2022)26, 8.1.3.2-8.1.3.6 adımlarını izleyerek.
      2. 1.0 g numuneyi (veya boş tahlil için damıtılmış suyu) doğru bir şekilde tartın ve sindirim tüplerinde iki Kjeldahl tableti ve 25 mLH2S04ile karıştırın.
        DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan H2SO4 güvenlik bilgi formuna bakın.
      3. Numunelerin sindirimini bir Kjeldahl çürütücüsünde 220 °C'de 30 dakika, ardından 400 °C'de 90 dakika gerçekleştirin.
      4. RT'ye soğutulduktan sonra, 80 mL damıtılmış su ekleyin ve oluşan amonyağı bromokresol yeşili ve metil kırmızısı içeren %4'lük bir H3BO3çözeltisinin 30 mL'sine damıtın. Bu adım alkali koşullar altında gerçekleşir (bir Kjeldahl damıtıcı kullanılarak% 40 NaOH ile damıtma.
        DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan bromokresol yeşili, metil kırmızısı ve %3 NaOH içeren H 40 BO40çözeltisinin güvenlik bilgi formuna bakın.
      5. Damıtılmış numuneleri, renkte grimsi pembeye bir değişiklik gözlenene kadar HCl 0.1 M ile titre edin.
      6. Numunenin nitrojen içeriği ile temsil edilen ham protein içeriğini hesaplayın ve aşağıdaki denklemi kullanarak 100 g'da g olarak ifade edin:
        Equation 3
        burada Vs, numune titrasyonunda kullanılan HCl hacmine (mL) karşılık gelir; Vb, boşlukta kullanılan hacme karşılık gelir; N, HCl normalliğine karşılık gelir; W, numune ağırlığına (g) karşılık gelir.
      7. Toplam yağ içeriği: Folch ve ark. (1957)27, 8.1.3.8-8.1.3.14 adımlarını izleyerek.
      8. CHCl3 ve MeOH'yi 2:1 (v:v) oranında karıştırarak Folch reaktifini hazırlayın.
        DİKKAT: Tedarikçi tarafından teslim edilen Folch reaktifinin Güvenlik Bilgi Sayfasına bakın.
      9. 1 g alikot numune içeren tüpleri test etmek için 5 mL Folch reaktifi ve 0.8 mL damıtılmış su ekleyin. 1 dakika boyunca bir girdapta karıştırın.
      10. Daha sonra 5 mL daha Folch reaktifi ekleyin ve 5 dakika homojenize edin. 1.2 mL %0.8 NaCl çözeltisi ekleyin ve 2 dakika homojenize edin.
      11. Numuneleri 7000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Organik fazı (alt faz) hidrofilik pamuk ve susuz sodyum sülfattan yuvarlak tabanlı bir cam şişeye süzün.
      12. Numune kaybını önlemek için, aynı koşullar altında 5 mLCHCl3 ilavesi, homojenizasyon, santrifüjleme ve filtrasyon adımlarını tekrarlayın.
      13. Toplanan organik fazlardan organik çözücüyü düşük basınçlı buharlaştırma ile çıkarın ve 105 °C'de 4 saat fırında bırakın. Numuneleri bir desikatörde soğutun.
      14. Aşağıdaki denklemi kullanarak 100 g'da g olarak ifade edilen yağ içeriğini hesaplayın:
        Equation 4
        burada W1 boş yuvarlak tabanlı cam şişe ağırlığıdır; W2 , numunenin başlangıç ağırlığıdır; W3 , numune ağırlığına sahip yuvarlak tabanlı cam şişedir.
      15. Ham lif içeriği: ISO 6865 (2000)28'den uyarlanmış bir metodoloji kullanarak ham lif içeriğini 8.1.3.16-8.1.3.22 adımlarını izleyerek belirleyin.
      16. 1 g numuneyi (W0) filtre tabanlı (referans P2) bir cam potaya tartın ve fiber analizörüne yerleştirin.
      17. İlk adım asit hidrolizidir: Her potanın kolonuna 150 mL %1.25H2S4, önceden ısıtılmış ve 2 mL köpük önleyici madde (n-oktanol) ekleyin; Kaynayana kadar ısıtın ve 30 dakika bekletin.
      18. Bu çözücünün çıkarılmasından sonra, bazik hidrolize devam etmek için üç kez deiyonize su ile yıkayın. Sıvısız kolona 150 mL %1.25 NaOH, önceden ısıtılmış ve 5 mL köpük önleyici madde ekleyin ve asit hidrolizi ile aynı ısıtma prosedürünü uygulayın.
      19. Son olarak, soğuk ekstraksiyon için 150 mL aseton ile üçlü yıkama yapın.
      20. Bu işlemden sonra potaları dikkatlice sistemden çıkarın ve 150 °C'de 1 saat fırına koyun. Son ağırlığı kaydedin (W1).
      21. Potaları 500 °C'de 3 saat boyunca bir kül fırınına yerleştirin ve ardından son ağırlığı (W2) kaydedin.
      22. Ham lif içeriğini hesaplayın ve aşağıdaki denklemi kullanarak sonuçları yüzde olarak ifade edin:
        %Ham Elyaf = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Yağ asidi (FA) profili: Fernández ve ark.(2015)29'a göre yağ asitleri profilini belirleyin, 8.1.3.24-8.1.3.29 adımlarını izleyin.
        NOT: Yağ asitleri metil esterleri (FAME'ler), öğütülmüş dondurularak kurutulmuş numunelerin doğrudan asit katalizli transmetilasyonu ile elde edilir. Tüm analizler üç nüsha halinde yapılır.
      24. 50 mg'lık bir numuneye metanol içinde 2 mL %2 (h/h)H2S04çözeltisi ekleyin ve karışımı sürekli karıştırarak 80 °C'de 2 saat dökün.
        DİKKAT: Tedarikçi tarafından teslim edilen metanolün güvenlik bilgi formuna bakın.
      25. RT'ye soğuduktan sonra, her numuneye 1 mL ultra saf su ve 2 mL n-heptan ekleyin, karışımı 1 dakika vorteksleyin ve 5 dakika santrifüjleyin.
        DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan n-heptan güvenlik bilgi formuna bakın.
      26. FAME'leri içeren üst n-heptan fazını (organik) geri kazanın ve gaz kromatografisi (GC) şişelerine aktarın.
      27. TR-FAME kılcal kolon (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm film kalınlığı), otomatik numune alma cihazı ve alev iyonizasyon detektörü (FID) ile donatılmış bir gaz kromatografında analiz yapın.
      28. Enjektörü (bölmesiz mod) 250 °C'ye ve dedektörü 280 °C'ye ayarlayın. Kolonun başlangıç sıcaklığını 75 °C'ye ayarlayın ve 1 dakika basılı tutun. Ardından 5 °C/dk'da 170 °C'ye yükseltin ve 10 dakika bekleyin. Ardından 5 °C/dk'da 190 °C'ye yükseltin ve 10 dakika daha tutun. Son olarak, 2 °C/dk'da 240 °C'ye yükseltin ve 10 dakika bekleyin. Helyumu taşıyıcı gaz olarak 1,5 mL/dk akış hızında kullanın. Sırasıyla 350 ve 35 mL/dk akış hızlarında hava ve hidrojen sağlayın.
      29. Elde edilen alıkonma sürelerini bir standartla karşılaştırarak FA profilini belirleyin ve sonuçları toplam yağın yüzdesi olarak ifade edin.
      30. Mineral elementler profili: Pinto ve ark. (2022)30, 8.1.3.31-8.1.3.34 adımlarını izleyerek, ICP-OES tarafından analiz edilen mineral elementleri (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) belirleyin.
      31. Her kuru numunenin yaklaşık 0,4 g'ını doğru bir şekilde tartın ve 7,5 mL HNO3 ve 2,5 mL HCl ekleyin.
        DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan HNO3 ve HCl güvenlik bilgi formuna bakın.
      32. Çürütme iki aşamalı bir süreci takip eder: Sıcaklığı 30 dakikada RT'den 90 °C'ye yükseltin (ve bu sıcaklıkta 30 dakika daha koruyun), ardından 105 °C'de 60 dakika.
      33. Numune çözeltilerini soğutun, 25 mL'ye seyreltin ve filtreleyin ve etiketli tüplerde saklayın. Her sindirimde, aynı işlemi bir referans materyal ve bir boşluk ile gerçekleştirin. ICP-OES ile farklı elementlerin konsantrasyonunu elde edin.
      34. Sonuçları 100 g fw başına mg olarak ifade edin.
      35. Karbonhidrat içeriği: 8.1.3.36-8.1.3.37 adımlarını izleyerek karbonhidrat içeriğini hesaplayın.
      36. Gıda ve Tarım Örgütü'ne (FAO; 2003) göre, aşağıdaki denklemi kullanarak, mevcut karbonhidrat (lif hariç) içeriğini 100 g başına önceden belirlenmiş faktörlerin farkı ile hesaplayın31
        Equation 5
      37. Sonuçları 100 g'da g olarak ifade edin.
      38. Nem ve kül içeriği: 8.1.3.39-8.1.3.45 adımlarını izleyerek nem ve kül içeriğini tahmin edin.
      39. Porselen potaları 105 °C'de 3 saat inkübe edin, bir kurutucuda soğutun ve tartın.
      40. Numunenin 10 g'ını potaya tartın ve ardışık ağırlıklardan elde edilen değerler 10 mg'dan fazla farklılık göstermeyene kadar 3 saat döngü boyunca 105 °C'de bir kurutma fırınına koyun.
      41. Aşağıdaki denklemi kullanarak 100 g fw başına g olarak ifade edilen nem içeriğini hesaplayın:
        Equation 6
        burada W1 boş potanın ağırlığı, W2 taze numune ile potanın ağırlığı ve W3 kurutulmuş numune ile potanın ağırlığıdır.
      42. Nem içeriği tahlilinden sonra, potaları kurutulmuş numunelerle birlikte 525 °C'de4 saat boyunca bir yakma fırınına yerleştirin.
      43. Ardışık ağırlıklar 1 mg'dan fazla farklılık göstermeyene kadar bu prosedürü tekrarlayın.
      44. Numuneleri bir kurutucuda RT'ye soğutun ve ardından tartın.
      45. Aşağıdaki denklemi kullanarak 100 g fw başına g olarak ifade edilen kül içeriğini hesaplayın:
        Equation 7
        burada W1 boş potanın ağırlığıdır, W2 taze numune ile potanın ağırlığıdır, W3 potanın ağırlıkla ağırlığıdır.
      46. Enerji değeri: 8.1.3.47-8.1.3.48 adımlarını izleyerek enerji değerini hesaplayın.
      47. Aşağıdaki denklemleri kullanarak AB yönetmeliğine göre numunelerin enerji değerini hesaplayın:Tüketicilere gıda bilgilerinin sağlanması (Yönetmelik 1169/2011)32:
        Enerji (kcal/ 100 g) = 4 x (g protein) + 4 x (g karbonhidrat) + 9 x (g yağ) + 2 x (g lif)
        Enerji (kJ/ 100 g) = 17 x (g protein) + 17 x (g karbonhidrat) + 37 x (g yağ) + 8 x (g lif)
      48. Sonuçları 100 g'da kilokalori ve 100 g'da kilojul olarak ifade edin.
    4. Tüketici kabulü
      1. Damıtılmış suda 8 dakika pişirilmiş makarna örneklerini kullanarak tüketici kabulünü değerlendirin.
      2. Tüketici kabul testi yapın: Numunelerin görsel görünümünü, rengini, dokusunu, kokusunu, deniz tadı, genel tadını, genel değerlendirmesini ve satın alma niyetini değerlendirin.
        NOT: Tüketici kabul testi, görsel görünüm, renk, doku, koku, deniz tadı, genel tat, genel değerlendirme ve satın alma niyetini 1-9 arasında değerlendiren hedonik testlere dayanmaktadır, burada 1 kötü bir değerlendirmedir ve 9 çok iyi bir değerlendirmedir.
      3. Bir duyusal analiz laboratuvarında (sıcaklık ve aydınlatma kontrolü ile) bireysel duyusal kabinlerde duyusal testler gerçekleştirin. Numuneler arasında damağı temizlemek için çatal bıçak takımı, peçeteler ve cam bardaklarda maden suyu sağlayın.
        NOT: Tadımcılar, tüm geçmişlerden 16-64 yaşları arasındadır (n > 80).
  2. Yoğurt
    1. Pigment ekstraksiyonu
      NOT: Pigment ekstraksiyonunu Pereira ve ark. (2020)18.
      1. Ekstraksiyon çözücüsünü, sodyum fosfat tamponunu 0.1 M'de, sodyum fosfat dibazik (0.03 M) ve sodyum fosfat monobazik (0.07 M) ile hazırlayın. NaOH veya HCl kullanarak pH'ı pH 6.8'e ayarlayın.
      2. 1 g G. gracilis tartın ve 50 mL sodyum fosfat tamponu (pH 6.8) ekleyin. 10 dakika homojenize edin, ardından harç ve havaneli ile 10 dakika maserasyon yapın.
      3. Çözeltiyi bir tüpe aktarın ve 12.298 x g'da (4 ° C) 20 dakika santrifüjleyin.
      4. Süpernatanı bir araya getirin ve yavaşça% 65 amonyum sülfat ekleyin. Tüm amonyum sülfat çözüldüğünde, çözeltiyi bir alüminyum levha ile örtün ve gece boyunca 4 °C'de çökelmeye bırakın.
        DİKKAT: Tedarikçi tarafından teslim edilen amonyum sülfat güvenlik bilgi formuna bakın.
      5. Çökeltiyi 12.298 x g'da (4 °C) 20 dakika santrifüjleyin. Peletleri geri kazanın ve damıtılmış suda (yaklaşık 5 mL) çözün.
      6. 24 saat boyunca suya karşı bir boru membranı (14 kDa) kullanarak ekstraktın diyalizini gerçekleştirin, ardından dondurarak kurutun. Dondurularak kurutulmuş özü kullanana kadar ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın.
    2. Yoğurt hazırlama
      1. 1 L pastörize süt, 120 gr doğal yoğurt, 20 gr şeker ve 50 gr süt tozunu bir termomikserde 5 dk, 50 °C, hız 3 karıştırarak doğal yoğurt hazırlayın.
      2. Karışımı termomikser kavanozuna 37 °C'de 12 saat inkübatörde yerleştirin.
      3. Ekstraktı yoğurtla %0.21 konsantrasyonda karıştırarak ekleyin. Numuneleri analize kadar 4 °C'de ayrı cam şişelerde saklayın.
      4. Yoğurdun tek tek kısımlarını pigmentsiz (kontrol) analize kadar 4 °C'de saklayın.
    3. Renk kararlılığı
      NOT: Yoğurtlardaki pigmentin stabilitesini 12 gün boyunca renk analizi ile değerlendirin. 2 derecelik standart bir gözlemci ve bir D65 aydınlatıcı kullanarak bir yansıma kolorimetresi kullanarak renk analizi yapın. Sonuçlar L (açıklık, siyah - beyaz, 0 - 100), a* (yeşil - kırmızı, -60 - 60) ve b* (mavi - sarı, -60 - 60) parametreleri ile CIELab koordinatları olarak sunulmuştur. a* parametresi kırmızımsı renkler için pozitif, yeşilimsi renkler için negatif değerler içerir. b* parametresi sarımsı renkler için pozitif, mavimsi renkler için negatif değerler alır. L*, her rengin siyah ve beyaz arasındaki gri tonlamanın bir üyesine eşdeğer kabul edilebileceği özellik olan parlaklık parametresidir33.
      1. Kolorimetreyi, üretici tarafından sağlanan beyaz bir seramik plaka (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) kullanarak kalibre edin.
      2. Bir hücreyi yaklaşık 28 g numune (veya kontrol) ile doldurun ve renk verisi analiz yazılımını kullanarak rengi analiz edin.
        NOT: Renk verisi analizi için kullanılan yazılım SpectraMagic NX idi.
      3. S'de 5 kez okuma yapınamp/kontrol üçlüleri.
    4. Duyusal analiz
      NOT: Bir üçgen testi (ISO 4120, 2004)34 ve renk, tat ve genel takdirin hedonik bir değerlendirmesini kullanarak pigment içeren yoğurtların duyusal değerlendirmesini yapın.
      1. Üçgen testi için panelistlere üç numune verin (bir pigmentli yoğurt numunesi ve iki kontrol numunesi veya pigmentli iki numune ve bir kontrol) ve aroma, doku ve tada göre farklı bir numune seçmelerini isteyin. Rastgele 3 rakamlı kodlarla tanımlanan benzer hacimlerde örnekler sağlayın.
      2. Pigmentli yoğurdun hedonik değerlendirmesi için, panelistlere pigmentli yoğurt örneği verin ve 9 puanlık bir hedonik ölçek kullanarak (aşırı beğenmeden aşırı sevmeye) rengi, tadı ve genel takdiri değerlendirmelerini isteyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antimikrobiyal aktivite

Elde edilen sonuçları yorumlarken, inhibisyon yüzdesi ne kadar yüksek olursa, ekstraktın o spesifik suşun büyümesini inhibe etmedeki etkinliğinin o kadar büyük olduğu ve sonuç olarak ekstraktın bir antimikrobiyal olarak o kadar ilginç olduğu unutulmamalıdır. Bu metodoloji sayesinde, hangi ekstraktların belirli bakteri suşları üzerinde daha fazla aktiviteye sahip olduğunu hızlı bir şekilde belirleyebilir ve ayrıca gelecekteki kullanım açısından en ilginç olanı belirleyebiliriz. Böylece aynı ekstrakt üzerinde daha fazla çalışma için bir başlangıç noktasına sahip olabiliriz.

Şekil 1, hem birinci hem de ikinci ekstraksiyonlarda, biyokütle kurutmadan hemen sonra (Şekil 1A) ve etanolik ekstraksiyonlardan sonra elde edilen üçüncü ve dördüncü ekstraksiyonlarda (Şekil 1B) sulu ekstraktlarla elde edilen sonuçları göstermektedir, böylece biyokütle entegre olarak kullanılmaktadır. Üçüncü ve dördüncü sulu ekstraksiyonlara karşılık gelen en ilginç sonuçların, özellikle 70 °C'de elde edilen ekstraktlarda daha yüksek antimikrobiyal aktiviteler ortaya çıkardığını görebiliriz. Kuyucuklardaki ekstrakt konsantrasyonu 5 mg/mL'dir.

Figure 1
Şekil 1: G. gracilis'in sulu ekstraktlarının varlığında bakteri türlerinin büyüme inhibisyonu. Farklı sıcaklıklarda, oda sıcaklığında (RT), 40 °C (40) ve 70 °C'de (70) elde edilen sulu ekstraktlar (Aq) varlığında, sıvı bir ortamda 24 saatlik büyümeden sonra 3 bakteri türünün (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) büyüme inhibisyonu. Pozitif kontrol kloramfenikol (CHL) ile yapıldı ve sonuçlar ortalama değerler (n=8) olarak ifade edildi. Veriler, 4 ardışık ekstraksiyon adımına (1st,2nd, 3rd, 4th) atıfta bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Etanolik ekstraktlar, Şekil 2'de gösterildiği gibi, L. anguillarum'un büyümesini inhibe etmede özellikle etkili görünmektedir. Bu, etanolik ekstraktlarla, ayrıca birinci ve ikinci ekstraksiyonlarda (Şekil 2A) ve birinci sulu ekstraksiyondan sonra elde edilen üçüncü ve dördüncü ekstraksiyonlarda (Şekil 2B) elde edilen sonuçları göstermektedir.

Figure 2
Şekil 2: G. gracilis'in etanolik ekstraktlarının varlığında bakteri türlerinin büyüme inhibisyonu. 3 bakteri türünün (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) 24 saatlik büyümeden sonra, sıvı bir ortamda, farklı sıcaklıklarda, oda sıcaklığında (RT), 40 °C (40) ve 70 °C'de (70) elde edilen G. gracilis'in etanolik ekstraktları (Et) varlığında büyüme inhibisyonu. Pozitif kontrol kloramfenikol (CHL) ile yapıldı ve sonuçlar ortalama değerler (n=8) olarak ifade edildi. Veriler, 4 ardışık ekstraksiyon adımına (1st,2nd, 3rd, 4th) atıfta bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Antioksidan aktivite

Çeşitli ekstraktların antioksidan potansiyelini vurgulayan sonuçlarla ilgili olarak, yani DPPH testinde, Şekil 3'te ifade edilen sonuçlar, 40 ° C'lik sıcaklığın en etkili olduğunu ve oksidan aktivitenin daha yüksek inhibisyon değerleri ile sonuçlandığını göstermektedir. Bu, G. gracilis örnekleri için geçerlidir ve kullanılan örneklere ve alg büyüme koşullarına bağlı olarak büyük farklılıklar olabilir. Bu nedenle, her bir spesifik numune türü için en iyi koşulları belirtmek üzere testlerin yapılması tavsiye edilir.

Figure 3
Şekil 3: Farklı sıcaklıklarda elde edilen ekstraktların varlığında DPPH radikalinin (%) inhibisyonu. Ekstraktlar, etanolik (Et) veya sulu (Aq) ekstraksiyon yoluyla elde edildi. 1. ve 2. ekstraksiyonlar kuru biyokütleden sırayla yapılmıştır. Kalanlar (3. ve 4.) daha önce alternatif çözücü ile ekstrakte edilen biyokütle ile yapılmıştır. RT, oda sıcaklığı anlamına gelir; 40, 40 °C'de elde edilen ekstrakt; ve 70, 70 °C'de elde edilen ekstrakt. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Toplam polifenol miktar tayini açısından benzer sonuçlar elde edildi (Şekil 4), 40 ° C'lik sıcaklık antioksidan bileşik ekstraksiyonu açısından en iyisi olarak kabul edildi. Bu, antioksidan aktivitenin, ekstraktlarda bulunan fenolik bileşenlerle ilişkili göründüğünü göstermektedir.

Figure 4
Şekil 4: Farklı sıcaklıklarda elde edilen ekstraktlardaki toplam polifenol içeriğinin (TPC) miktar tayini. Ekstraktlar, etanolik (Et) veya sulu (Aq) ekstraksiyon ile elde edildi, burada 1. ve 2. ekstraksiyon kuru alglerden sırayla yapıldı ve geri kalanı (3. ve 4.) daha önce başka bir çözücüile ekstrakte edilen biyokütle ile yapıldı. RT, oda sıcaklığı anlamına gelir; 40, 40 °C'de elde edilen ekstrakt; ve 70, 70 °C'de elde edilen ekstrakt. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

HaCat hücrelerinde sitotoksisite

Kozmetik bileşenlerin güvenliğini değerlendirmenin ilk adımı, epidermal ve dermal hücre hatlarındaki in vitro sitotoksisitelerinin incelenmesidir. Şekil 5'te görülebileceği gibi, keratinositler (HaCaT hücreleri) üzerinde sitotoksik etki gözlenmemiştir, bu da maksimum test edilen konsantrasyonda (1 mg / mL), hem sulu hem de etanol ekstraktlarının kutanöz kullanım için güvenli olduğunu düşündürmektedir.

Figure 5
Şekil 5: Gracilaria gracilis ekstraktlarının (1 mg/mL) 24 saatlik tedaviden sonra HaCaT hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi. Her sütundaki değerler, üç kopya halinde üç bağımsız deneyin ortalamasının (SEM) ortalaması ± standart hatası olarak ifade edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gıda inovasyonu

Nihai makarna formülasyonları, yarı eğitimli bir panel tarafından teorik formülasyon ve duyusal testler arasında yapılan çok sayıda denemeden sonra elde edildi. Bu adımdan sonra, beslenme değerlendirmesi, yağ asitleri ve mineral element profilleri dahil olmak üzere kimyasal karakterizasyona erişildi. Bir beslenme karakterizasyonu oluşturmak (Tablo 1 ve Tablo 2) ve Avrupa mevzuatına (REG (AB) No. 1169/2011)32 dayalı olarak beklenen beslenme iddialarının varlığını doğrulamak mümkün olmuştur.

Besin değerleri 100 g Makarna % RDI
Enerji 1478.90 kJ (348.74 kcal) 17
Lipit 1,06 ± 0,10 g 2
Neyden:
Doymuş Yağ Asitleri 0,38 ± 0,01 g 2
Karbonhidrat 72,59± 0,21 g 28
Lif 3.84 ± 0.20 g
Protein 10.29 ± 0.20 g 21
Tuz 0,22 ± 0,02 g 9

Tablo 1: Beslenme gerçekleri. Geliştirilen makarnanın besin değerleri, hesaplama ile elde edilen enerji ve karbonhidratların kimyasal analizlerine (n=3) ve önerilen doz alımının ilgili yüzdesine (n = 3) dayanmaktadır.

Bu makarna formülasyonları, daha sağlıklı bir diyete sahip bir hedef tüketiciye hitap edecek şekilde tasarlanmıştır, bu nedenle 100 g ürün başına yağ miktarı mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Yağ asidi profilinin ayrıntılı analizi, düşük doymuş yağlı ürünler için sınırın oldukça altında olan 0,38 g doymuş yağ asitleri/100 g değerini gösterir ve bu makarnanın üretimindeki ilk hedefi karşılar. Lif içeriği ile ilgili olarak, Avrupa yönetmeliklerine uygun olarak, bu makarna formülasyonunun bir lif kaynağı olduğunu iddia etmek de mümkündü.

ICP-OES tarafından belirlenen ve Tablo 2'de sunulan mineral element karakterizasyonunda, bu ürünün 100 g'ında bulunan yaklaşık 219 mg/100 g Na değeri bildirilmektedir, bu nedenle düşük sodyum içeriğine sahip bir ürün olduğu doğrulanamamaktadır (<0.12 g/100 g). Bileşenlerde doğal olarak bulunan yüksek sodyum içeriği nedeniyle, bu ürün şekerlemesine tuz eklenmesini gerektirmeyebilir.

Table 2

Tablo 2: Makarna mineral elementleri profili. Mavi - yüksek element içeriği; Kırmızı - belirli bir elementin kaynağı (n = 3). Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Atıfta bulunulan Avrupa Birliği yönetmeliğine ve her bir element için RDI%'ye göre, bu ürünün yüksek K, P, Fe içeriğine sahip olduğu ve aynı zamanda bir Zn kaynağı olduğu görülebilir. Daha küçük miktarlarda Se, Mg ve Ca'ya sahiptir.

Makarna kabul testleri için 18 yaş üstü 63'ü kadın, 23'ü erkek olmak üzere 86 test cihazı kullanılmıştır. Kabul testleri, standartlarda belirtildiği gibi 9 puanlık hedonik ölçeklere dayanıyordu. Sağlıklı hamur, "Deniz tadı" ve "Görsel görünüm" parametreleri için sırasıyla 1'den 9'a kadar hedonik bir ölçekte 5 ve 6 puan aldı (Şekil 6).

Figure 6

Şekil 6: Duyusal tüketici kabul testlerinden elde edilen sonuçlar . (A) Görsel görünüm, renk, doku, koku, deniz tadı ve genel tat için hedonik seçim. (B) Genel takdir ve satın alma niyeti için hedonik seçim. Ölçek 1-9, burada 1 kötü bir değerlendirmedir ve 9 çok iyi bir değerlendirmedir (n = 86). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Makarna, "Deniz tadı" ve "Görsel görünüm" parametreleri için sırasıyla 1'den 9'a kadar hedonik bir ölçekte 5 ve 6 puan aldı (Şekil 6A). Bu makarna, doku parametresi ile ilgili olarak bu ölçekte düşük bir değer elde etti (daha önce incelenen diğer formülasyonlar göz önüne alındığında), muhtemelen temel bileşen pirinç unu olduğu için; Buna rağmen, ortalama bir tüketici tarafından iyi bir kabulü yansıtan 4 ile 7 arasında değişen 1'den 9'a kadar bir ölçekte değerler elde etti. 1'den 9'a kadar hedonik bir ölçekte, makarna, Şekil 6B'de gösterildiği gibi, satın alma niyeti için 5 değerine ve genel takdir için 6 değerine en sık yanıt verdi. Tadımcıların yaklaşık% 65'inin bu makarnanın genel değerlendirmesi için 6 puanına eşit veya daha yüksek bir yanıt seçtiği bulundu. Pigmentli yoğurtların renk stabilitesi -4 °C'de 12 gün boyunca değerlendirilmiş ve sonuçlar Şekil 7'de sunulmuştur.

Figure 7
Şekil 7: Yoğurtların renk stabilitesi. (solda) Yoğurtları ve (sağ) yoğurtları 12 günlük depolama sırasında Gracilaria gracilis pigmenti ile kontrol edin. a*, b* ve L* parametreleri boyutsuzdur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar, a* ve b* parametrelerinin zaman içinde kararlı olduğunu, L* değerlerinin ise daha yüksek varyans gösterdiğini göstermektedir. Hafiflik, 8 günlük depolamadan sonra daha yüksek değerler gösterdi. Açıklık parametrelerinde, numunelerin zamanla daha açık olduğunu gösteren bazı farklılıklar bulunurken, kırmızılık (a*) ve mavi (b*) parametreleri iyi stabilite göstermiştir. Ekstraktların yoğurtlara dahil edilmesi, 12 günlük depolamadan sonra 7.01 ± 2.36 ΔE ile iyi bir renk tutma gösterdi. Yoğurdun duyusal değerlendirmesi ile ilgili olarak, 13 panelistten 9'u üçgen testinde doğru örneği doğru bir şekilde tanımladı ve bu ayrıma izin veren yoğurtlar arasında farklılıklar olduğunu düşündürdü. Yarı eğitimli panele yapılan hedonik testler, 7'nin üzerindeki puanlara yansıyan ürünün iyi bir şekilde kabul edildiğini gösterdi (Şekil 8). Test edilen üç özellikten herhangi biri için puan modu 9 idi ve bu da puan ortalamalarının 8'in üzerinde olmasına yol açtı. En iyi değerlendirme, panel tarafından mükemmel bir kabulü yansıtan renge yapıldı, bu da açıklayıcı bir sonuçtu.

Figure 8
Şekil 8: Gracilaria gracilis pigmenti ile yoğurdun hedonik duyusal değerlendirmesinin sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sıvı bir ortamda antimikrobiyal aktivite testleri, antimikrobiyal maddelerin sıvı bir ortamda asılı kalan mikroorganizmalara karşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmaktadır ve genellikle bir maddenin büyümeyi engelleme veya mikroorganizmaları öldürme yeteneğini belirlemek için yapılmaktadır35,36,37,38. Mikroorganizmaların antimikrobiyal ajanlara duyarlılığını değerlendirmek için kullanılırlar ve antimikrobiyal maddenin farklı konsantrasyonlarının hedef mikroorganizmanın22 standartlaştırılmış bir süspansiyonuna karşı test edildiği test tüplerinde veya mikrotitrasyon plakalarında gerçekleştirilirler. Antimikrobiyal aktivite, uygun bir inkübasyon süresinden sonra kültür ortamında mikrobiyal büyüme veya bulanıklığın varlığı/yokluğu ölçülerek değerlendirilir.

Bu testleri gerçekleştirmek için et suyu seyreltme yöntemi, agar difüzyon yöntemi (disk difüzyon testi gibi) ve en çok kullanılanlardan biri olan et suyu mikrodilüsyon yöntemi gibi çeşitli teknikler ve yöntemler bulunmaktadır38. Bu yöntemlerdeki en kritik noktalardan bazıları, aşının uygun şekilde hazırlanması, kültür ortamının seçimi, kullanılan antimikrobiyallerin kalitesi, tekniğin standardizasyonu ve etkili kontaminasyon kontrolüdür. Mikroorganizmaların standartlaştırılmış bir süspansiyonu olan aşı, sonuçların doğruluğunu sağlamak için doğru şekilde hazırlanmalıdır. Bu, uygun bir mikrobiyal kültür seçimini, uygun bir saf suş kültürünü, hücre konsantrasyonunun ayarlanmasını ve uygun bir optik yoğunluk veya hücre konsantrasyonu elde etmek için süspansiyonun standardizasyonunu içerir.

Kullanılan kültür ortamı, test edilen mikroorganizma için ideal büyüme koşullarını sağladığından emin olmak için dikkatlice seçilmelidir. Kimyasal bileşim, pH ve diğer faktörler test sonuçlarını etkileyebilir. Kültür ortamının hazırlanması için üreticinin tavsiyelerine uymak önemlidir. Kontrol olarak kullanılan antimikrobiyal ajanların kalitesi esastır ve bunların saf, raf ömrü içinde ve doğru şekilde saklanmasını sağlamak önemlidir. Üreticinin talimatlarına uyarak etiketleme ve son kullanma tarihlerine her zaman başvurulmalıdır. Tekniğin standardizasyonu, sonuçların doğruluğunu sağlamak için de çok önemlidir. Bu, test edilen konsantrasyonların kültür ortamına eklenmesini ve ayrıca prosedür boyunca aseptik koşulların korunmasını içerir. Ek olarak, test sırasında mikroorganizmaların çapraz kontaminasyonu yanlış veya güvenilmez sonuçlara yol açabilir. Aşının manipülasyonundan tüplerin veya plakaların inkübasyonuna kadar prosedür boyunca katı aseptik uygulamaları takip etmek esastır. Temiz tezgah kullanımı, uygun pipetleme teknikleri ve malzemelerin uygun şekilde atılması, kontaminasyonu önlemek için önemli önlemlerdir.

Sıvı bir ortamda yapılan antimikrobiyal aktivite testlerinde hataları en aza indirmek ve sonuçların güvenilirliğini sağlamak için ayrıntılara dikkat etmek ve yerleşik protokollere ve yönergelere sıkı sıkıya bağlı kalmak çok önemlidir. Ayrıca, antimikrobiyal aktivite testlerinin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır37.

Bu testlerde pH, sıcaklık, kan bileşenlerinin varlığı ve bağışıklık sistemi ile etkileşimler gibi faktörler dikkate alınmaz, bu da canlı bir organizmada bir antimikrobiyal ajanın etkinliğini tahmin etme yeteneğini sınırlayabilir. Ayrıca testler, bir antimikrobiyal maddenin mikrobiyal büyümeyi engelleme veya mikroorganizmaları öldürme yeteneğini ölçer ve antimikrobiyalin etki mekanizması veya belirli mikroorganizmalara karşı seçiciliği hakkında ayrıntılı bilgi sağlamaz. Kullanılan yöntemler zaman içinde direnç gelişiminin tespit edilmesine veya tahmin edilmesine izin vermeyebileceğinden, direncin tespit edilmesinde sınırlamalar vardır. Bazı mikroorganizmalar, bir antimikrobiyale uzun süre maruz kalmaya yanıt olarak direnç mekanizmaları geliştirebilir ve bu değişiklikler bu testlerle kolayca tespit edilemeyebilir. Sıvı bir ortamda antimikrobiyal aktivite testleri genellikle biyofilmlerin varlığı veya konakçının bağışıklık tepkisi gibi bir antimikrobiyal ajanın etkinliğini etkileyebilecek diğer konakçı faktörlerini dikkate almaz.

Bu sınırlamaları göz önünde bulundurmak ve sıvı bir ortamda antimikrobiyal aktivite testini in vivo çalışmalar, biyofilm modelleri ve diğerleri gibi diğer yöntem ve yaklaşımlarla tamamlamak önemlidir39. Biyoaktif makroalg bileşikleri için biyoprospeksiyon alanında, antimikrobiyal aktivite testleri, alg ekstraktlarının veya izole bileşiklerin antimikrobiyal potansiyelini değerlendirmek, ilaç, kozmetik, gıda veya tarım ürünleri üretimi gibi alanlarda uygulamaları olabilen spesifik mikrobiyal patojenlere karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip maddeleri tanımlamak için kullanılabilir40.

Antioksidan aktivite testleri, bir bileşiğin veya ekstraktın serbest radikalleri nötralize etme veya oksidatif stresi azaltma yeteneğini değerlendirmek için kullanılan yöntemlerdir. Bu testler, antioksidan araştırmalarında, hem gıdalarda hem de örneğin algler gibi doğal ürünlerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Antioksidan aktiviteyi değerlendirmek için çeşitli yöntemler vardır ve en yaygın kullanılanlardan biri serbest radikal emme kapasitesidir. Bu testte, kararlı bir serbest radikal olan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), bir bileşiğin bir elektron bağışlama ve serbest radikali nötralize etme yeteneğini değerlendirmek için kullanılır. Antioksidan aktivite, antioksidan bileşik serbest radikallere bir elektron bağışladığında ortaya çıkan DPPH'nin mor renginin azaltılmasıyla ölçülür. Diğer yöntemler arasında oksijen radikali absorpsiyon kapasitesi (ORAC), demir indirgeme kapasitesi (FRAP) veya serbest radikal indirgeme kapasitesi (ABTS)41 bulunur.

Öte yandan, toplam polifenollerin (QTP) miktar tayini, antioksidan aktiviteyi belirlemek için doğrudan bir yöntem değildir, ancak bir numunedeki toplam polifenol konsantrasyonunun bir ölçüsünü sağlar, ancak birkaç enterferans yapan madde sonuçları etkileyebilir. Birçok polifenolün antioksidan özelliklere sahip olduğu bilinmesine rağmen, bir bileşiğin antioksidan aktivitesi, kimyasal yapısı, konsantrasyonu, serbest radikalleri bağışlama veya yakalama yeteneği ve diğer hücresel bileşenlerle etkileşimleri gibi çeşitli faktörlerle ilişkilidir42. Toplam polifenollerin basit miktar tayini, numunenin antioksidan aktivitesinin bir değerlendirmesini sağlayamaz. Bununla birlikte, birçok polifenol antioksidan özelliklere sahip olduğundan, bir numunedeki polifenollerin varlığının daha yüksek bir antioksidan aktivite olasılığı ile ilişkili olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, QTP, numunedeki polifenollerin varlığının bir ön göstergesi olarak hizmet edebilir, ancak antioksidan aktivitenin doğrulanması, antioksidan aktivite deneyleri gerektirir. Polifenoller, gıdalarda, bitkilerde, meyvelerde, sebzelerde ve alglerde bulunan, doğada yaygın olarak bulunan bir kimyasal bileşikler sınıfıdır. Toplam polifenollerin miktar tayini için farklı yöntemler vardır ve Folin-Ciocalteu yöntemi en çok kullanılanlardan biridir. QTP, polifenollerin konsantrasyonunun genel bir ölçüsünü verir, ancak numunede bulunan tek tek polifenolik bileşikleri belirtmez. Bu nedenle, nicel bir yöntemdir ancak nitel bir yöntem değildir. Ayrıca, farklı polifenollerin farklı antioksidan kapasitelere ve biyolojik aktivitelere sahip olduğunu dikkate almak önemlidir, bu nedenle QTP, mevcut polifenollerin spesifik fonksiyonel özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi sağlamaz.

Her yöntemin avantajları ve sınırlamaları vardır ve belirli bir testin seçimi, incelenen bileşiğin özelliklerine ve analizin amacına bağlıdır. Güvenilir ve karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için her yöntemin özel talimatlarını takip etmek önemlidir. Antioksidan kapasiteyi belirlerken, yaygın kritik adımlardan bazıları, ilk olarak numune hazırlamayı içerir. Numunelerin doğru şekilde hazırlanması, yeterli konsantrasyonların elde edilmesinin sağlanması ve kontaminasyonun önlenmesi önemlidir. Bu, bileşiklerin veya ekstraktların hassas bir şekilde tartılmasını ve bunların uygun çözücüler içinde çözülmesini içerir. Hazırlama, depolama ve taşıma işlemi sırasında bileşiklerin ve ekstraktların stabilitesini dikkate almak da önemlidir. Antioksidan aktivite testlerinde kullanılan tüm reaktifler, sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için uygun şekilde hazırlanmalı ve standardize edilmelidir. Bu, gallik asit standardının doğru hazırlanmasını ve hacimlerin doğruluğunu içerir. Reaksiyon süresi, antioksidan testlerde doğru sonuçlar almanın kritik bir yönüdür. Antioksidan bileşik ile serbest radikal arasında tam bir reaksiyon sağlamak için inkübasyon süresini optimize etmek gerekir. Yetersiz zaman, antioksidan aktivitenin hafife alınmasına neden olabilirken, aşırı zaman, bileşiklerin bozulmasına veya ikincil reaksiyonlardan kaynaklanan parazitlere neden olabilir. Ayrıca, testler sırasında sıcaklığın doğru ve tutarlı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. Sıcaklık, kimyasal reaksiyonların hızını etkiler ve sonuçları etkileyebilir. Belirli yöntemlerle önerilen sıcaklık koşullarını takip etmek ve prosedür boyunca sıcaklık stabilitesini sağlamak önemlidir. Antioksidan testlerin sonuçlarını doğrulamak için uygun kontrollerin dahil edilmesi esastır. Bu, pozitif kontrolleri (antioksidan aktiviteye sahip olduğu bilinen bileşikler) ve negatif kontrolleri (antioksidan aktivitesi olmayan numuneler) içerebilir. Kontroller, sonuçların yorumlanması için karşılaştırma için bir temel sağlar ve elde edilen verilerin doğruluğunun sağlanmasına yardımcı olur. Güvenilir sonuçlar elde etmek için, verilerin önemini artırmak ve daha güvenilir ve sağlam sonuçlar elde etmek için kopyalar üzerinde antioksidan aktivite testleri yapılması ve deneyi birkaç kez tekrarlamanız önerilir.

Antioksidan aktivite test yöntemlerinin, sonuçları yorumlarken göz önünde bulundurulması gereken bazı sınırlamaları vardır, yani, sıvı ortamda, biyolojik sistemlerin karmaşıklığını ve farklı bileşikler arasındaki etkileşimleri, meydana gelebilecek çok çeşitli antioksidan reaksiyonları, hücresel metabolizmayı ve antioksidan aktiviteyi etkileyebilecek çevresel faktörler. Bu nedenle, farklı testler kullanılmalıdır. Sağlık yararları ile doğrudan korelasyon eksikliğinin de farkında olunmalıdır; Antioksidan aktivite genellikle sağlık yararları ile ilişkilendirilse de, biyoyararlanım, metabolizma ve diğer biyolojik sistemlerle etkileşimler gibi diğer birçok faktör nedeniyle bu her zaman canlı organizmalarda doğrudan sağlık yararlarına dönüşmez.

Antioksidan aktivite testlerinin, bileşiklerin ve ekstraktların antioksidan potansiyelinin ilk değerlendirmesi için yararlı araçlar olduğunu, ancak biyolojik etkilerin veya sağlık yararlarının kesin bir göstergesi olarak düşünülmemesi gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Antioksidanların vücut üzerindeki etkisini tam olarak anlamak için ek çalışmalara ihtiyaç vardır.

Sıvı ortamda antioksidan aktiviteyi test etme yöntemleri araştırmalarda yaygın olarak kullanılmasına ve avantajları ve sınırlamaları olmasına rağmen, alternatifleriyle karşılaştırıldığında bu yöntemlerin pratiklik, hız, maliyet ve uygulama kolaylığı açısından iyi olduğu düşünülebilir. Başlıca avantajlarından biri, prosedürlerin basitliği ve hızı ile ilk araştırma, bileşik tarama ve büyük ölçekli çalışmalar için uygunluklarıdır. Bu yöntemlerin uygulanması nispeten hızlıdır ve kısa sürede, daha uygun maliyetli bir şekilde sonuç verebilir ve diğer yöntemlere kıyasla daha az özel ekipman gerektirir.

Algler, yararlı sağlık özelliklerine sahip olabilecek antioksidanlar da dahil olmak üzere biyoaktif bileşikler üretme yetenekleriyle bilinir43. Yosun özleri, alglerin farklı kısımlarından hazırlanabilir ve diğerlerinin yanı sıra su, etanol, metanol veya aseton gibi farklı çözücüler kullanılarak elde edilebilir. Yosun ekstraktlarının antioksidan aktivitesinin, alg türleri, ekstraksiyon metodolojisi ve mevcut biyoaktif bileşiklerin konsantrasyonu gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, daha güvenilir sonuçlar elde etmek için replikatlar üzerinde antioksidan aktivite testleri yapılması ve uygun kontrollerle karşılaştırmalar yapılması önerilmektedir. Bu yöntemler, daha ileri çalışmalar için antioksidan potansiyele sahip alg ekstraktlarının taranmasında ve seçiminde bir başlangıç aracı olarak kullanılabilir.

MTT testi, insan ve hayvan kullanımı için maddelerin in vitro sitotoksik etkilerinin ön değerlendirmesi için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, sitotoksisiteyi test etmek için en çok kullanılan yöntem olmasına rağmen, MTT'nin formazan kristallerine dönüşümü, metabolik hız ve mitokondri sayısı gibi çok sayıda faktörden etkilenir ve yalnızca yapışkan hücre hedeflerineuygulanabilir 14. Burada açıklanan protokolün ana kritik adımları, hücre kültürü kontaminasyonlarının nihai olarak ortaya çıkması, istenmeyen HaCaT hücrelerinin büyümesi ve düşük hücre birleşme yüzdesi ile ilgilidir. Sitotoksisiteyi ölçmek için laktat dehidrojenaz (LDH), adenozin trifosfat (ATP) ve koloni oluşum testleri gibi başka yöntemler de vardır. Ancak, hepsinin avantajları ve kısıtlamaları vardır. Ghasemi ve ark. (2021)44 , çeşitli değişkenlerin bir prostat kanseri hücre dizisi (PC-3) üzerindeki MTT tahlil ölçümleri üzerindeki etkisini değerlendirdi. Hücre tohumlama yoğunluğu, MTT konsantrasyonu, MTT ilavesinden sonraki inkübasyon süresi, serum açlığı, hücre kültürü ortamının bileşimi, salınan hücre içi içerikler ve formazanın hücre dışı boşluğa ekstrüzyonu gibi faktörler analiz edildi. Bu çalışmadan, tahlilin nasıl uygulanacağına dair faydalı öneriler ve tahlilin faydasının nerede güçlü bir araç olduğuna, ancak aynı şekilde sınırlamaları olduğuna dair bir bakış açısı bu yazarlar tarafından özetlenmiştir. Bununla birlikte, MTT testi, terapötik, gıda, yem, tarım ve çevre alanlarında potansiyel uygulama ile birçok maddenin ön sitotoksisite değerlendirmesi olarak uygulanabilen hızlı, oldukça hassas ve kolay bir metodolojidir. Özellikle, burada gerçekleştirilen MTT testi, etanol ve G. gracilis'ten elde edilen sulu ekstraktların, test edilen konsantrasyonlarda, keratinosit canlılığını etkilemediğini ve insan kutanöz kullanımı için tamamen güvenli olduklarından emin olmak için in vivo deneylere devam edebileceğini kanıtladı.

Gıda ürünlerinde deniz kaynaklarının kullanılması, sadece besin değeri katma ürünler elde etmek için değil, aynı zamanda daha temiz etiketli ürünler bulmak için de potansiyelini bir kez daha göstermiştir. Bütün G. gracilis (makarna) veya ekstraktının (gıda boyası olarak) eklenmesi pazar potansiyelini gösterir ve uygulanması, şirketlerin pazarda öne çıkması, tüketicilerin beslenme ihtiyaçlarını karşılaması ve pazar trendlerini takip etmesi için stratejilerden biri olabilir.

Makarna formülasyonlarına deniz yosunu eklendiğinde, başlangıçta yapının değiştiği ve istenen hamur şekillerini elde etmenin mümkün olmadığı tespit edildi. Makarnanın dokusunu korumak amacıyla miktarları ayarlama ve daha önce öngörülemeyen diğer malzemeleri ekleme zorluğuyla karşılaştık. Her bir bileşenin uygun miktarının yanı sıra, ekstrüzyon yöntemi makarnanın gelişimi boyunca uyarlanmıştır. Bu zorluğun yanı sıra, yeni ürünlerin geliştirilmesi üç temel ilkeye dayanmaktadır: ürün duyusal çekiciliğe sahip olmalıdır (doku, lezzet, koku); ürün besin değeri katmış olmalıdır; ve sürdürülebilir içerik ve metodolojilerden maksimum düzeyde yararlanmalıdır. Bu anlamda, bir diğer önemli zorluk, en çekici formülasyonu elde etmek için duyusal panelin kullanılmasıdır. Makarna üzerinde gerçekleştirilen fizikokimyasal analizlerin çoğu, gıda matrisleri için zaten optimize edilmişti; Bununla birlikte, bu çalışmada, numune hazırlama, tüm analiz yöntemlerine verimli bir şekilde uygulanabilmesi için optimize edilmiştir.

G. gracilis pigmentinin renklendirici olarak kullanımı ile ilgili olarak, bu tip molekülün45 termal duyarlılığı nedeniyle soğutulmuş bir ürün seçilmiştir. Yoğurt hazırlama ısıl işlem içerdiğinden, pigment nihai ürüne eklenmiştir. Pigmentin yoğurtta karıştırılması, pigmentsiz kontrolden biraz daha akışkan bir ürünle sonuçlandı. Aslında, üçgen testinin sonunda, bazı panelistler örnekler arasındaki tek farkın doku olduğu yorumunu yaptılar. Bu iyi bir sonuçtur, çünkü üçgen testinin temel amacı, deniz yosunu özleri gıda ürünlerine hoş olmayan tat/koku verebileceğinden, pigmentli ve pigmentsiz yoğurt arasında, özellikle tat ve koku farklılıklarında gözle görülür farklılıklar olup olmadığını doğrulamaktı. Bu, küçük, yarı eğitimli bir paneli içeren bir ön çalışmaydı. Daha ileri çalışmalarda, daha güvenilir pazar sonuçları elde etmek için daha fazla sayıda tadımcı düşünülmelidir. Yoğurtta pigment stabilitesinin değerlendirilmesine gelince, daha ileri çalışmalar, yoğurdun zaman içinde pigmentli pH, su aktivitesi (aw) ve doku gibi diğer fizikokimyasal özelliklerinin değerlendirilmesini içerebilir. Zaman içinde duyusal değerlendirme de arzu edilir.

Sonuç olarak, burada açıklanan protokoller, kırmızı deniz yosunu G. gracilis'in farmasötik, dermokozmetik ve gıda endüstrilerinde potansiyel uygulamalara sahip yeni ürünler geliştirmek için bir bileşen kaynağı olarak potansiyelini vurgulamaktadır. Ayrıca, ekstrakte edilen artık biyokütle, su arıtma amacıyla biyokömür ve/veya işlevselleştirilmiş karbonlar elde etmek için bitki büyüme biyostimülanı, toprak zenginleştirme, balık besleme veya hammadde olarak uygulanacak değerli bir malzeme olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan biyorafineri yaklaşımı, mavi döngüsel ekonomiyi ve çevresel sürdürülebilirliği teşvik ederek diğer deniz yosunu türlerine uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT) tarafından MARE-Deniz ve Çevre Bilimleri Merkezi'ne (UIDP/04292/2020 ve UIDB/04292/2020) ve Ortak Laboratuvar ARNET'e (LA/P/0069/2020) verilen Stratejik Projeler aracılığıyla desteklenmiştir. FCT ayrıca Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) ve Tatiana Pereira'ya (2021) verilen bireysel doktora hibelerini de finanse etti. 07791. BD). Bu çalışma aynı zamanda Portekiz 2020 Programı kapsamında ERDF - Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu tarafından ortaklaşa finanse edilen HP4A - HERKES IÇIN SAĞLIKLI MAKARNA (ortak tanıtım no. 039952) projesi tarafından COMPETE 2020 - Rekabet Edebilirlik ve Uluslararasılaşma Operasyonel Programı aracılığıyla finansal olarak desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol Aga, Portugal 64-17-5
Ammonium Chloride PanReac 12125-02-9
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Analytical scale balance Sartorius, TE124S 22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 347
Biotin Panreac AppliChem 58-85-5
Centrifuge Eppendorf, 5810R 5811JH490481
Chloramphenicol PanReac 56-75-7
CO2 Chamber Memmert N/A
Cool White Fluorescent Lamps OSRAM Lumilux Skywhite N/A
Densitometer McFarland Grant Instruments N/A
DMEM medium Sigma-Aldrich D5796
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5
DPPH Sigma, Steinheim, Germany 1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM5922
Ethanol 96% AGA-Portugal 64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) J.T.Baker 6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Filter Paper (Whatman No.1) Whatman WHA1001320
Flasks VWR International, Alcabideche, Portugal  N/A
Folin-Ciocalteu VWR Chemicals 31360.264
Gallic Acid  Merck 149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999% AlfaAesar 1310-53-8
HaCaT cells – 300493 CLS-Cell Lines Services, Germany  300493
Hot Plate Magnetic Stirrer IKA, C-MAG HS7 06.090564
Iron Sulfate VWR Chemicals 10124-49-9
Laminar flow hood TelStar, Portugal 526013
LB Medium  VWR Chemicals J106
Listonella anguillarum German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)  DSM 21597
Manganese Chloride VWR Chemicals 7773.01.5
Micropipettes  Eppendorf, Portugal N/A
Microplates VWR International, Alcabideche, Portugal  10861-666
Microplates Greiner 738-0168
Microplates (sterile) Fisher Scientific 10022403
Microplate reader  Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA 1611151E
MTT Sigma-Aldrich 289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB) VWR Chemicals 90004-658
Oven Binder, FD115 12-04490
Oven Binder, BD115 04-62615
Penicillin Sigma-Aldrich 1406-05-9
pH meter Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal  15212099
Pippete tips Eppendorf, Portugal 5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal  16157-169
Rotary Evaporator Heidolph, Laborota 4000 80409287
Rotavapor IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal 07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3) Chem-Lab 497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)  Normax Chem 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Riedel-de Haën 7558-79-4
SpectraMagic NX Konica Minolta, Japan color data analysis software
Spectrophotometer Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA 5A4T092004
Streptomycin Sigma-Aldrich 57-92-1
Thiamine Panreac AppliChem 59-43-8
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
Tryptic Soy Agar (TSA) VWR Chemicals ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)  VWR Chemicals 22091
Ultrapure water  Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany F5HA17360B
Vacuum pump Buchi, Switzerland FIS05-402-103
Vitamin B12 Merck 68-19-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822 (2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Tags

Biyoloji Sayı 201
Kırmızı Deniz Yosunu <em>Gracilaria gracilis'in</em> Biyorafineri Yaklaşımı ile Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso,… More

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso, S., Pereira, T., Mouga, T., Afonso, C., Freitas, M. V., Pinteus, S., Pedrosa, R., Gil, M. M. Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach. J. Vis. Exp. (201), e65923, doi:10.3791/65923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter