Summary
Das hier vorgestellte experimentelle Design bietet ein nützliches Reproduktionsmodell für die Untersuchung von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der Metastasierung von Lymphknoten (LN), das die Störung von CD8+ T-Zellen ausschließt.
Abstract
Tumorantigen-spezifische CD8+ T-Zellen aus drainierenden Lymphknoten gewinnen eine zunehmende Bedeutung für die Erhöhung der Anti-Tumor-Immunantwort während der Tumorentstehung. In vielen Fällen bilden Krebszellen jedoch metastasierende Loci in Lymphknoten, bevor sie weiter in entfernte Organe metastasieren. Inwieweit die lokalen und systematischen CD8+ T-Zell-Antworten durch LN-Metastasen beeinflusst wurden, bleibt unklar. Zu diesem Zweck haben wir ein murines LN-Metastasenmodell in Kombination mit einer B16F10-GP-Melanomzelllinie aufgebaut, die das Surrogat-Neoantigen exprimiert, das aus dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV), dem Glykoprotein (GP) und P14-transgenen Mäusen stammt, die T-Zell-Rezeptoren (TCRs) beherbergen, die spezifisch für das GP-abgeleitete Peptid GP33-41 sind, das vom Klasse-I-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Molekül H-2Db präsentiert wird. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung antigenspezifischer CD8+ T-Zell-Antworten während der LN-Metastasierung. In diesem Protokoll wurden C57BL/6J-Mäusen subkutan B16F10-GP-Zellen implantiert, gefolgt von einem adoptiven Transfer mit naiven P14-Zellen. Als der subkutane Tumor auf einen Durchmesser von etwa 5 mm anwuchs, wurde der Primärtumor herausgeschnitten und B16F10-GP-Zellen wurden direkt in den tumordrainierenden Lymphknoten (TdLN) injiziert. Anschließend wurde die Dynamik der CD8+ T-Zellen während des Prozesses der LN-Metastasierung überwacht. Insgesamt hat dieses Modell einen Ansatz zur präzisen Untersuchung der antigenspezifischen CD8+ T-Zell-Immunantworten während der LN-Metastasierung geliefert.
Introduction
Die Krebsimmuntherapie, insbesondere die Immun-Checkpoint-Blockade (ICB), hat die Krebstherapie revolutioniert1. ICB blockiert die koinhibitorischen Immunrezeptoren (wie PD-1, Tim-3, LAG-3 und TIGIT), die in erschöpften CD8+ T-Zellen in der Tumormikroumgebung (TME) stark exprimiert werden, was zur Wiederbelebung erschöpfter CD8+ T-Zellen führt2. Unter Berücksichtigung der Heterogenität erschöpfter CD8+ T-Zellen zeigten sich häufende Beweise, dass tumorspezifische CD8+ T-Zellen, die aus der Peripherie stammen, einschließlich drainierender Lymphknoten (dLN), aber nicht in TME, die Wirksamkeit von ICBvermitteln 3,4,5,6,7,8. Kürzlich wurde bestätigt, dass TdLN-abgeleitete TCF-1+TOX-tumorspezifische Gedächtnis-CD8+-T-Zellen (TdLN-TTSM) die echten Responder auf ICB sind, die mehrere funktionelle Eigenschaften herkömmlicher Gedächtnis-T-Zellen verkörpern und sich nach der ICB-Behandlung weiter ausdehnen und zu Nachkommen differenzieren könnten9. Insgesamt bestätigten diese Ergebnisse die Bedeutung von LN für die Erhöhung der Anti-Tumor-Immunität.
Der Lymphknoten fungiert als kritischer Ort bei der Erleichterung des Primings und der Aktivierung tumorspezifischer CD8+ T-Zellen, indem er sowohl strukturelle Grundlagen als auch biologische Signale bereitstellt10. Mehrere Arten von Krebszellen säen häufig Wächterlymphknoten (SLN, das erste LN, das einen Primärtumor entwässert), bevor sie sich systematisch ausbreiten11. Das Vorhandensein von SLN-Metastasen ist mit einem schlechten Ergebnis bei menschlichem Krebs verbunden, und präklinische Modelle zeigten, dass sich Tumorzellen in TdLN sowohl über die Lymphgefäße als auch über die Blutgefäße des Knotens 12,13,14,15 auf entfernte Organe ausbreiten können. Die SLN-Biopsie stellt heute ein Standardverfahren dar, um spätere Behandlungsentscheidungen bei vielen soliden Tumorarten zu treffen, wodurch eine unnötige Resektion von unbeteiligten LN vermieden werden könnte16,17. Selbst für die betroffenen LN bleibt es umstritten, ob und wann eine chirurgische Resektion erforderlich ist, da mehrere Studien gezeigt haben, dass die Entfernung der regionalen LN kein verbessertes Gesamtüberleben im Vergleich zu denjenigen zeigte, die eine Strahlen- oder systemische Therapie ohne regionale LN-Resektion erhielten18,19. Eine Interpretation ist, dass metastasiertes LN (mLN) mit mikroskopischer Erkrankung eine gewisse Fähigkeit zur Bildung von Immunzellen behalten und einige therapeutische Vorteile bieten kann. Daher ist es von entscheidender Bedeutung zu klären, wie sich die LN-Metastasierung auf die Anti-Tumor-Immunantwort auswirkt, insbesondere auf die Eigenschaften und Funktionen von TdLN-TTSM.
Bisher haben sowohl präklinische als auch klinische Daten einige strukturelle und zelluläre Veränderungen in mLN20 gezeigt. Die dynamischen Veränderungen von tumorspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung wurden jedoch nicht beschrieben. Daher ist die Entwicklung eines überzeugenden Modells der LN-Metastasierung für weitere Untersuchungen erforderlich. In der Tat haben mehrere Studien mLN-Mausmodelle auf unterschiedliche Weise berichtet 14,21,22. Beispielsweise wurde eine spontane Metastasierung in axillären LNs durch die Implantation von 4T1-Brustkrebszellen in das Brustfettpolsterdurchgeführt 22. In einer anderen Studie erzeugten Reticker-Flynn et al. Melanomzelllinien mit hoher Inzidenz der Ausbreitung von subkutanem Primärtumor auf LNs durch serielle Inokulation von Tumorzellen, die aus dissoziierten mLN-Geweben kultiviert wurden (neun Runden)14. Ein weiteres häufig verwendetes Modell wurde durch die Injektion von Tumorzellen in den Fußballen hergestellt, und die metastatischen Loci wurden in poplitealem LN22 gebildet. Insbesondere ist es schwierig, die genauen Zeitpunkte der Intervention zu bewerten, da die LN-Metastasierung in diesen Modellen nicht immer originalgetreu ist.
In der vorliegenden Studie wurde ein murines LN-Metastasierungsmodell durch intranodale Injektion von B16F10-GP-Zellen23,24 etabliert, das durch CRISPR/Cas9-vermittelte Insertion der LCMV-Virus-Glykoprotein-Gensequenz (GP) in das Genom der B16F10-Zelllinie9 erzeugt wurde. Anschließend wurden diese Mäuse mit P14-Zellen übertragen, die transgene T-Zell-Rezeptoren (TCRs) beherbergen, die spezifisch das H-2Db GP33-41-Epitop 25,26 erkennen, und die systemische und lokale Dynamik von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung konnte untersucht werden. Unser experimentelles Design bietet ein nützliches Modell für die Untersuchung von Immunantworten, insbesondere der antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung, die die Störung von CD8+ T-Zellen ausschließt. Diese Ergebnisse würden sich auf die klinischen Behandlungsoptionen auswirken, ob das mLN entfernt oder beibehalten werden soll, und ein neues Licht auf die Manipulation von mLN werfen, um einen maximalen therapeutischen Nutzen zu erzielen.
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Protocol
Die verwendeten C57BL/6J-Mäuse (als B6-Mäuse bezeichnet) und die naiven P14-transgenen Mäuse 9,27 waren 6-10 Wochen alt und wogen 18-22 g. Sowohl Männer als auch Frauen wurden ohne Randomisierung oder Verblindung eingeschlossen. Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Qingdao Agricultural University durchgeführt.
1. Herstellung von Medium und Reagenzien
- Bereiten Sie B16F10-GP Melanom-Zellkulturmedium mit dem Namen D10 (vollständiges DMEM-Medium) vor, indem Sie DMEM, 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % L-Glutamin mit zusätzlichen 100 U/ml Puromycin hinzufügen. Bewahren Sie ein steriles D10 auf und lagern Sie es bis zu 2 Wochen bei 2-4 °C.
- Bereiten Sie R2-Medium (zur Beendigung der Lyse roter Blutkörperchen) vor, indem Sie RPMI-1640 mit 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin hinzufügen.
- Bereiten Sie einen Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) vor, indem Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % FBS und 0,01 % Natriumazid hinzufügen. Die Zugabe von Natriumazid kann die Lagerzeit von FACS-Puffer verlängern, der monatelang bei 2-4 ° C gelagert werden kann.
- Bereiten Sie den Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen (RBL) vor, indem Sie 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in doppelt destilliertes Wasser geben und den pH-Wert auf 7,3 einstellen. Lagern Sie den RBL-Puffer bei Raumtemperatur (RT) und er bleibt bis zu 3 Monate stabil.
- Bereiten Sie das Anästhetikum 2,2,2-Tribromethanol wie unten beschrieben vor.
- Wiegen Sie eine angemessene Menge 2,2,2-Tribromethanolkristall in einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen ab, das mit Aluminiumfolie umwickelt ist. Geben Sie eine angemessene Menge 2-Methyl-2-butanol in den Kristall, um die Stammlösung mit einer Konzentration von 500 mg/ml herzustellen.
- Zum Mischen schwenken und das Röhrchen in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen, bis sich der Kristall aufgelöst hat. Stellen Sie sicher, dass alle Kristalle aufgelöst sind.
- Mischen Sie die Lösung gründlich. Die Stammlösung mit einem 0,22 μm Filter in einen sterilen Behälter filtrieren. Die Stammlösung wird eingefroren, lichtgeschützt bei -20 °C gelagert oder mit PBS zu einer Arbeitslösung in einer Konzentration von 12,5 mg/ml verdünnt und bei 4 °C gelagert.
HINWEIS: Verwenden Sie am besten die vorgeschriebene Konzentration, da höhere Konzentrationen der Flüssigkeit reizend sind.
2. Herstellung der B16F10-GP-Zellsuspension
- Ein Fläschchen mit 1 x 106 B16F10-GP-Zellen mit 5 ml D10 in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 auftauen und kultivieren. Subkulturzellen, wenn sie eine Dichte von 80 % bis 90 % erreichten, wie unten beschrieben.
- Entsorgen Sie das ursprüngliche Kulturmedium durch Aspiration mit einer Pipettierpistole und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS. Wenn Sie adhärente Zellen mit PBS in einer Zellkulturschale reinigen, bewegen Sie das PBS an die Seitenwand oder lassen Sie es in die Schale fallen.
- Nach der Aspiration von PBS 0,5-1 ml 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellkulturschale oder den Zellkulturkolben geben. Schütteln Sie vorsichtig, um die gesamte Zelloberfläche zu bedecken. Die Zellkulturschale oder der Zellkolben wird etwa 1 Minute lang bei 37 °C oder RT in einen Inkubator gestellt, bis die Zellen abgerundet und getrennt sind. Beobachten Sie das Peeling der Zellen mit Hilfe eines inversen Mikroskops.
- Fügen Sie das gleiche Volumen frisch formulierten D10 hinzu, um den Trypsinverdau zu beenden. Spülen Sie die Unterseite des Zellkulturkolbens mit einer Pipettierpistole, um sicherzustellen, dass alle Zellen getrennt wurden.
- Die B16F10-GP-Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und bei 163 x g für 4 min bei RT zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand an und entsorgen Sie ihn. Resuspendieren Sie die Zellen in 1-2 ml D10 zur Ausfällung. Die B16F10-GP-Zellsuspension wird in eine neue Zellkulturschale oder einen neuen Zellkulturkolben mit 8-10 ml D10 überführt und dann in einem Zellinkubator bei 37 °C bei 5 % CO2 inkubiert.
- Am Tag der Tumorimplantation werden B16F10-GP-Zellen mit einer Dichte von etwa 90 % gesammelt, wie in den Schritten 2.1.1 bis 2.1.4 beschrieben. Nach dem Zentrifugieren den Überstand absaugen und verwerfen. Resuspendieren Sie den Zellausfall in 1 ml PBS.
- Zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem 0,4%igen Trypanblau-Hämozytometer. Fügen Sie PBS hinzu, um die Zelle auf 5 x 105 Zellen pro 100 μl zu verdünnen. Legen Sie die Zellen bis zur Verwendung auf Eis.
3. Ektopische Inokulation von B16F10-GP-Zellen in der bilateralen Leistenregion von Mäusen
- Aspirieren Sie 100 μl der vorbereiteten B16F10-GP-Zellsuspension mit einer 1-ml-Spritze. Schnippen Sie die Rohrwand, um die Blasen nach oben zu bewegen, und drücken Sie den Kolben, um die obere Blase herauszubewegen.
- Halten Sie die Maus in Rückenlage und legen Sie ihren Bauch frei. Drücken Sie mit einem Finger auf die rechte Hinterschenkel der Maus in Rückenlage, so dass die Haut in der rechten Leistengegend vollständig freigelegt ist (Gleiches gilt für die linke Leistengegend).
- Entfernen Sie das Fell am Bauch mit Enthaarungscreme und reinigen Sie dann den beidseitigen Bauchbereich mit Baumwolle mit 75% Ethanol.
- Stellen Sie vor dem Einführen der Nadel sicher, dass die Haut in der Leistengegend gestrafft ist. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 45° in den Unterhautraum der Leistengegend des Oberschenkels ein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel nach oben abgeschrägt ist und die Tiefe der Nadel 0,5-1 cm beträgt.
- Wenden Sie vor der Injektion eine sanfte Absaugung an, wenn kein Blut vorhanden ist, injizieren Sie die langsam in das Unterhautgewebe injizierten Zellen. Gleichzeitig ist ein kleiner Bolus (Bildung einer Flüssigkeitstasche) im Unterhautbereich zu beobachten.
- Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel, legen Sie sie in die Schachtel für scharfe Gegenstände und setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig.
4. Adoptiver Transfer von P14-T-Zellen in tumortragende Mäuse
- Führen Sie den adoptiven Transfer bei tumortragenden Mäusen 6-8 Tage nach der Tumorimplantation durch, wenn die Tumoren tastbar sind (ca. 3-5 mm Durchmesser). Intraperitoneal injizieren Sie 4 mg Cyclophosphamid am Tag vor dem Transfer 28,29,30.
HINWEIS: Das Ziel der CTX-Injektion ist es, im lymphatischen Kompartiment Platz für adoptiv übertragene T-Zellen zu schaffen, indem proliferierende Lymphozyten vorübergehend eliminiert werden. - Isolieren Sie Lymphozyten aus der Milz und den LNs naiver P14-transgener Mäuse wie unten beschrieben31,32 (6-10 Wochen alt, gleiches Geschlecht wie tumortragende Mäuse, um Abstoßungsprobleme zu vermeiden).
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank durch, um streng sterile Bedingungen zu gewährleisten.- Bereiten Sie zwei 6-cm-Schalen vor und geben Sie 3 ml R2-Medium in eine der Schalen und 3 ml RBL-Puffer in die andere Schüssel. Setzen Sie einen 70-μm-Zellfilter in die Petrischale mit RBL-Puffer.
- Ethanasieren Sie P14-Mäuse in luftdichten Behältern, die Isofluran enthalten, gefolgt von einer Zervixluxation. Passen Sie die Anzahl der P14-Mäuse an die Anzahl der Empfängermäuse an.
- Entnehmen Sie die Milz-, Leisten- und Achsellymphknoten der euthanasierten Mäuse und übertragen Sie sie in 6-cm-Schalen mit 4 ml R2-Medium und legen Sie sie auf Eis.
- Legen Sie die Milz in ein mit 3 ml RBL-Puffer getränktes Sieb und schleifen Sie die Milz mit dem Putter in der 1-ml-Spritze. Inkubieren Sie die Zellen 1-2 Minuten lang bei RT und beenden Sie dann die Reaktion mit 3 ml kaltem R2-Medium.
- Mahlen Sie die LNs mit dem Putter in der 1-ml-Spritze, bis nur noch Bindegewebe im Sieb mit einem 70-μm-Zellfilter verbleibt. Spülen Sie den Filter mit kaltem R2-Medium und geben Sie die Zellsuspension in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Proben werden bei 500 x g für 6 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 3 ml PBS. Verwenden Sie einen 70-μm-Zellfilter, um flockiges Material aus der Zellsuspension zu entfernen.
- Die Zellsuspension wird bei 500 x g 6 min bei 4 °C zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen mit 3 ml PBS und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Nehmen Sie eine kleine Probe, mischen Sie sie mit Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einer Blutzellzählplatte.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz der P14-Zellen (lebend/tot-CD45.1+CD8+Vα2+) durch Durchflusszytometrie. Stellen Sie sicher, dass die übertragenen Spenderzellen einen eindeutigen kongenen Marker mit Empfängermäusen aufweisen (tumortragende B6-Mäuse sind CD45.2+). Führen Sie vor dem Transfer eine Färbung durch, um den korrekten Phänotyp der übertragenen Zellen zu überprüfen.
- Geben Sie 5 x 104-1 x 105 Zellen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml FACS-Puffer. Die Zellsuspension bei 500 x g bei 4 °C 3 min zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand, schnippen Sie mit dem Boden des Röhrchens, um die Zellen zu verteilen, und legen Sie das Röhrchen auf Eis.
- Bereiten Sie die folgende konjugierte Antikörpermischung 9,32 in 100 μl FACS-Puffer verdünnt vor: Anti-CD8, 1:200; Anti-TCR Vα2, 1:100; Anti-CD45.1, 1:200; Lebende/tote Flecken, 1:400. (Tabelle der Materialien).
- Zentrifugieren Sie das Antikörpergemisch bei 15.000 x g für 3 Minuten, um die Partikel zu aggregieren. Legen Sie die Mischung auf Eis und schützen Sie sie vor Licht, indem Sie sie in Folie einwickeln. Nehmen Sie nur den Überstand, um die Aspiration von Teilchen zu vermeiden.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl des Antikörpergemisches und mischen Sie sie gründlich durch Schnippen der Röhrchenwand. Nach dem Einwickeln in Alufolie das Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit FACS-Puffer. Das Röhrchen bei 500 x g bei 4 °C 3 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen mit 200 μl FACS-Puffer und überführen Sie die Zellsuspension in ein Durchflussröhrchen.
- Führen Sie das Durchflussrohr mit gefärbten Zellen auf einem Durchflusszytometer, um den Prozentsatz der lebenden/toten CD45.1+CD8+Vα2+ -Zellen zu bestimmen.
HINWEIS: Im Allgemeinen enthielten über 90 % der CD8+ T-Zellen von P14-transgenen Mäusen Vα2+TCRs, die spezifisch für das H-2Db GP33-41-Epitop von LCMV (lymphozytäres Choriomeningitis-Virus) sind.
- Berechnen Sie die absolute Anzahl der lebenden/toten CD45.1+CD8+Vα2+-Zellen, indem Sie ihren Prozentsatz mit der in den Schritten 4.2 und 4.3 erhaltenen Anzahl lebender Zellen multiplizieren.
- 200 μl P14-Zellsuspension (5 x 105 Zellen) mit einer 100 U-Insulinspritze absaugen und Blasen entfernen. Die anfängliche Anzahl der übertragenen naiven P14-Zellen (5 x 103 - 5 x 105) hatte keinen Einfluss auf den Phänotyp der übertragenen Zellen9.
- Legen Sie die Mäuse in einen Käfig und erwärmen Sie sie mit einer Infrarotlampe für 5-10 Minuten, um die Schwanzvene zu erweitern. Halten Sie ihn mit einem Mäusefixateur in geeigneter Größe fest, richten Sie den Schwanz aus und wischen Sie ihn mit einem Wattebausch mit 75% Ethanol ab, um die Venen sichtbar zu machen.
- Führen Sie die Nadel parallel zur Schwanzvene ein und ziehen Sie den Kolben vorsichtig zurück. Wenn Blut in die Spritze fließt, drücken Sie die Zellsuspension langsam in die Vene.
Anmerkungen: Wenn der Schwanz während der Injektion Widerstand oder Schwellung aufweist, muss die Injektionsposition angepasst werden. Die Injektionsstelle sollte am distalen Ende beginnen. - Ziehen Sie nach Abschluss der Injektion die Nadel schnell heraus und drücken Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit einem Wattebausch an. Setzen Sie die Maus wieder in einen neuen, sauberen Käfig und beobachten Sie ihn einige Minuten lang genau auf schädliche Auswirkungen.
5. Resektion des Primärtumors
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente vor der Verwendung autoklaviert sind. Sterilisieren Sie den Operationsbereich in der Biosicherheitswerkbank mit 75% Ethanol, gefolgt von einer UV-Bestrahlung für mindestens 30 min. Tragen Sie während der Operation saubere Kittel, Hüte, Masken und sterile Handschuhe.
- Wenn der Tumor tastbar ist (ca. 5 mm Durchmesser), resezieren Sie den Primärtumor.
- Betäuben Sie die Mäuse mit intraperitonealer Injektion von Ketamin (75 mg/kg). Kneifen Sie das Fußpolster zusammen, um den Grad der Anästhesie zu beurteilen, wenn kein Schmerzreflex vorliegt, zeigt dies den richtigen Zeitpunkt für die Operation an. Wenn die Hinterbeine zurückgezogen wurden, geben Sie eine weitere Dosis von 10-30 μl.
HINWEIS: Alternativ können intraperitoneale Medetomidin (1 mg/kg Körpergewicht; Domitor) wird zur Betäubung von Mäusen empfohlen. - Tragen Sie die trocknende vorbeugende Salbe auf die Mausaugen auf. Entfernen Sie das Fell am Bauch mit Enthaarungscreme, um das Operationsfeld vollständig freizulegen.
- Legen Sie die Maus in eine Biosicherheitswerkbank und legen Sie sie in Rückenlage auf eine anatomische Platte, die mit sauberem saugfähigem Papier bedeckt ist, so dass die Längsachse der Maus parallel zum Experimentator verläuft.
HINWEIS: Um eine streng sterile Umgebung aufrechtzuerhalten, müssen die folgenden Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. - Desinfizieren Sie den Bauch der Mäuse mit einem in Povidon-Jod getränkten Wattebausch. Schneiden Sie die Haut in der Nähe der tumortragenden Stelle mit einem sterilen Skalpell oder einer Augenschere ein. Führen Sie die geschlossene Scherenspitze in den Einschnitt ein, um den Tumor deutlich freizulegen. Achten Sie beim Einschneiden der Haut darauf, die Leistenlymphknoten nicht zu beschädigen.
- Halten Sie die Kapsel während der Tumorentfernung so intakt wie möglich. Entfernen Sie vorsichtig und vorsichtig das an den Tumor angrenzende Bindegewebe mit einer sterilen Schere. Entfernen Sie den Tumor vollständig in situ , da er sonst erneut auftreten kann.
6. Intranodale Injektion von B16F10-GP-Zellen in den Leistenlymphknoten
HINWEIS: Nach der bilateralen Tumorbeseitigung wurden B16F10-GP-Zellen in den einseitigen Leistenlymphknoten und PBS in die andere Seite injiziert.
- 20 μl (5 x 104 Zellen) B16F10-GP-Zellsuspension mit einer 100 U Insulinspritze aspirieren, Blasen entfernen und anschließend in einen Leistenlymphknoten injizieren. Injizieren Sie ein gleiches Volumen PBS in den Leistenlymphknoten auf der anderen Seite.
- Führen Sie während der Injektion die Nadel vom distalen Ende des Lymphknotens aus und führen Sie die Nadel dann langsam in die Mitte des Lymphknotens ein. Wenn die Flüssigkeit zu diesem Zeitpunkt genau in den Lymphknoten injiziert wird, kann man sehen, dass der Lymphknoten erheblich anschwillt.
Anmerkungen: Wenn die Nadel vom distalen Ende des Lymphknotens eingeführt wird, achten Sie darauf, den Knoten nicht zu punktieren.
- Führen Sie während der Injektion die Nadel vom distalen Ende des Lymphknotens aus und führen Sie die Nadel dann langsam in die Mitte des Lymphknotens ein. Wenn die Flüssigkeit zu diesem Zeitpunkt genau in den Lymphknoten injiziert wird, kann man sehen, dass der Lymphknoten erheblich anschwillt.
- Nähen Sie den Schnitt mit 2-3 Stichen mit einer 3-0-Naht. Desinfizieren Sie die Haut um die Wunde herum mit Baumwolle, die mit Povidon-Jod imprägniert ist. Achten Sie darauf, Lymphknoten während des Nähens zu umgehen.
- Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig und halten Sie sie mit Infrarotlicht in der seitlichen Dekubitusposition warm. Überwachen Sie kontinuierlich, bis das Bewusstsein wiederhergestellt ist. Stellen Sie sicher, dass die operierten Mäuse nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht werden, bis sie sich vollständig erholt haben.
- Geben Sie Buprenorphin alle 4-6 Stunden an 3 aufeinanderfolgenden Tagen nach der Operation, um postoperative Schmerzen zu lindern (in einer Dosis von 0,1-0,5 mg/kg, SQ oder IP). Überwachen Sie die Fütterungs-, Trink-, Bewegungs- und Aktivitätsbereiche der Mäuse. Typischerweise erholen sich Mäuse innerhalb von 3 Tagen von einem chirurgischen Trauma.
HINWEIS: Wenn Mäuse nicht in der Lage sind, die normale Fütterung und Aktivität wieder aufzunehmen und Anzeichen einer Infektion zeigen, wenden Sie sich an einen Tierarzt, um einzugreifen, oder euthanasieren Sie sie. - Opfern Sie Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten: Tag 8 und Tag 18 nach intranodaler Injektion von Tumorzellen. Gewinnen Sie aktivierte Spenderzellen mittels Durchflusszytometrie-Analyse.
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Representative Results
Das schematische Diagramm dieses Versuchsdesigns ist in Abbildung 1A dargestellt. Insgesamt wurden 5 x 105 B16F10-GP-Zellen in 100 μl PBS subkutan (s.c.) in die bilaterale Leistenregion von CD45.2 C57BL/6J-Mäusen implantiert. Nach 7 Tagen wurden diesen tumortragenden Mäusen intraperitoneal (i.p.) 4 mg CTX injiziert, gefolgt von der adoptiven Übertragung von 5 x 105 CD45.1+P14-Zellen durch intravenöse (i.v.) Schwanzinjektion. Wenn die Tumore auf einen Durchmesser von etwa 3-5 mm anwuchsen (etwa 7 Tage nach dem P14-Zelltransfer), wurden Primärtumoren reseziert und 5 x 104 B16F10-GP-Zellen in 20 μl PBS direkt in den einseitigen Leistenlymphknoten injiziert. Der Leistenlymphknoten auf der anderen Seite wurde mit gleichen Mengen PBS injiziert. Die repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E, 100x) des nicht-metastasierten Lymphknotens (nLN) und des metastasierten Lymphknotens (mLN) zu angegebenen Zeitpunkten ist in Abbildung 1B dargestellt. Die Struktur von nLN war intakt. Im frühen Stadium der LN-Metastasierung (D8) war mLN teilweise mit Tumorzellen besetzt (schwarzer Pfeil), und es gibt noch einige verbleibende Bereiche mit Lymphozyten, die nicht von Tumorzellen befallen wurden (roter Pfeil). Im späten Stadium der LN-Metastasierung (D18) ist mLN mit Tumorzellen gefüllt, die von Tumorangiogenese und kleinen Lymphozyten begleitet werden. Aktivierte P14-Zellen, die in TdLN gewonnen wurden, produzierten nach GP33-41-Peptidstimulation einen hohen Gehalt an IFN-γ 9,31. Hier wurden die Prozentsätze der aktivierten P14-Zellen durch Durchflusszytometrie zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert und die Gating-Strategie ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Häufigkeit antigenspezifischer CD8+ T-Zellen im peripheren Blut im Frühstadium (D8) und im Spätstadium (D18) beträgt 2,81 % bzw. 1,48 % (Abbildung 3A). Es wurde berichtet, dass sich tumorspezifische CD8+ T-Zellen während der Tumorgenese ausschließlich in dLN aufhalten, und nicht drainierende LN gewannen begrenzte Spenderzellen33. Der Prozentsatz der antigenspezifischen P14-Zellen in nLN war während der LN-Metastasierung stabil. Interessanterweise wurden antigenspezifische CD8+ T-Zellen in mLN im Frühstadium vorübergehend verstärkt, was durch die höhere Häufigkeit von P14-Zellen im Vergleich zu nLN belegt wird, während sie im Spätstadium stark abnahm (Abbildung 3B).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsdesigns. (A) C57BL/6J-Mäusen (CD45.2+) werden 5 x 105 B16F10-GP-Tumorzellen auf der bilateralen Leistenregion implantiert. Nach 7 Tagen werden diesen Mäusen intraperitoneal 4 mg CTX injiziert, gefolgt von der adoptiven Übertragung verschiedener kongen markierter (CD45.1+) P14-Zellen am nächsten Tag. Wenn Tumore auf einen Durchmesser von etwa 3-5 mm anwachsen (etwa 7 Tage nach dem Transfer der P14-Zellen), werden Primärtumoren reseziert, dann werden 5 x 104 B16F10-GP-Zellen in 20 μl PBS direkt in den einseitigen Leistenlymphknoten injiziert, und der Leistenlymphknoten auf der anderen Seite wird mit gleichen Mengen PBS injiziert. (B) Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E,100x) der LNs. Abkürzungen: s.c. = subkutan; CTX= Cyclophosphamid; i.v. = intravenös; Sac = Opfer; nLN = nicht metastasierendes LN; mLN = metastasierendes LN. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse. Gating-Strategie zur Identifizierung von aktivierten Antigen-spezifischen CD8+ -T-Zellen aus Spendern. Abkürzungen: L/D = lebend/tot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Dynamik von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung. Der Anteil antigenspezifischer CD8+ T-Zellen in (A) peripherem Blut, (B) nLN und mLN zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Abkürzungen: nLN = nicht-metastasiertes LN; mLN = metastasierendes LN. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Während der Tumorentstehung verschlingen antigenpräsentierende Zellen (APCs) Tumorantigene und wandern zu TdLN, wo sie CD8+ T-Zellen primen. Nach dem Priming und der Aktivierung verlassen CD8+ T-Zellen das TdLN und infiltrieren den Tumor, um Tumorzellen abzutöten10. Durch die TdLN-Resektion und die Verabreichung von FTY720, die den Austritt von Immunzellen aus den lymphatischen Organen blockieren, haben mehrere Studien die zentrale Rolle von TdLN bei der Sicherstellung der Wirksamkeit der PD-1/PD-L1-Checkpoint-Therapie gezeigt34,35. In Übereinstimmung damit haben wir kürzlich festgestellt, dass tumorspezifische Gedächtnis-CD8+-T-Zellen (T-TSM) überwiegend in TdLN residieren, diese TdLN-T-TSM-Zellen dienen als echte Responder auf ICB9. Leider breiten sich verschiedene Arten von Krebszellen häufig von Primärtumorstellen auf TdLNs aus, was zu einer strukturellen Rebestätigung und einer Dysfunktion der Immunzellen in TdLNs führt. Die beeinträchtigte Quantität und Qualität von CD8+ T-Zellen in mLNs wurde bereits beschrieben20,36. Die dynamischen Veränderungen von CD8+ T-Zellen, insbesondere der Tumorantigen-spezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierungskaskade, wurden jedoch nicht aufgeklärt.
Hier haben wir ein praktisches Mausmodell entwickelt, um die Dynamik systemischer und lokaler antigenspezifischer CD8+ T-Zellen während des Prozesses der LN-Metastasierung zu überwachen. B16F10-GP-Melanomzellen wurden subkutan in die bilaterale Leistenregion implantiert, gefolgt von einem adoptiven Transfer mit P14-Zellen, die spezifisch durch das GP-abgeleitete Peptid GP33-41 aktiviert werden konnten. Am Tag 7 nach dem Zelltransfer, als P14-Zellen in inguinalen LNs vollständig aktiviert waren, wurden Primärtumore auf beiden Seiten reseziert und B16F10-GP-Zellen direkt in unilaterales inguinales LN injiziert, wurde die Scheinoperation auf der anderen Seite durch die Injektion mit gleichen PBS-Volumina durchgeführt. Dieses ausgeklügelte Design ermöglicht den Vergleich von P14-Zellen in mLN und nicht-metastasiertem LN (nLN) innerhalb derselben Maus. Gleichzeitig wurden P14-Zellen im peripheren Blut derselben Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten während der LN-Metastasierung durch Blutung der Orbitavene nachgewiesen. Neben den Häufigkeiten von P14-Zellen im peripheren Blut und TdLNs in verschiedenen Stadien während der LN-Metastasierung konnten die transkriptionellen und epigenetischen Eigenschaften dieser antigenspezifischen CD8+ T-Zellen mit anderen Techniken weiter untersucht werden.
Zu beachten ist, dass einige Schritte vorsichtig durchgeführt werden sollten. Zunächst sollten die Primärtumoren gründlich herausgeschnitten werden, da die verbleibenden Tumorzellen schnell nachwachsen würden. Zweitens sollte die Operation schonend durchgeführt werden, da Tumorgewebe reichlich neue Blutgefäße enthält, die bei der Primärtumorresektion meist unweigerlich gebrochen werden und bei chirurgischen Mäusen durch massive Blutungen zum Tod führen. Daher ist der Zeitpunkt der Primärtumorresektion von entscheidender Bedeutung. Im Allgemeinen ist es relativ sicher, es zu entfernen, wenn der Tumor auf eine Größe von etwa 5 x 5 mm anwächst, und Tumorzellen sollten präzise in LN und nicht in den Boden oder benachbarte Gewebe injiziert werden. Darüber hinaus sollte das Volumen der Tumorzellsuspensionen unter 20 μl kontrolliert werden, da sonst eine Verschüttung einen neuen Tumor außerhalb des LN bilden würde. Schließlich besteht eine Einschränkung dieses Protokolls darin, dass die Operation traumatisch ist und Mäuse während des Heilungsprozesses eine Infektion erleiden können, die die Eigenschaften antigenspezifischer CD8+ T-Zellen beeinträchtigen würde. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, während der Operation eine strikte Asepsis aufrechtzuerhalten, und es sollte eine scheinoperierte PBS-Injektion durchgeführt werden, um die Auswirkungen einer injektionsinduzierten physischen Schädigung der antigenspezifischen CD8+ T-Zellen auszuschließen.
Insgesamt bieten wir ein geeignetes Modell, um die antigenspezifischen CD8+ T-Zellen während der LN-Metastasierung zu untersuchen, und die Wechselwirkungen zwischen antigenspezifischen CD8+ T-Zellen und anderen Immunzellen oder Stromazellen während der LN-Metastasierung konnten ebenfalls aufgeklärt werden. Darüber hinaus könnte es leicht auf mehrere andere Tumormodelle ausgeweitet werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein nützliches Reproduktionsmodell für die Untersuchung der Krebsimmunologie.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (Nr. 82122028 bis LX), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82173094 bis LX), der Natural Science Foundation of Chong Qing (Nr. 2023NSCQ-BHX0087 bis SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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