Summary
Манипулирование РНК-интерференцией (РНК-интерференцией) представляет собой серьезную проблему для многих паразитоидных видов с миниатюрными размерами, таких как осы Trichogramma . В этом исследовании описан эффективный метод РНК-интерференции у Trichogramma denrolimi. Данная методология представляет собой надежную модель для исследования регуляции генов у ос типа Trichogramma .
Abstract
Паразитоиды яиц, Trichogramma spp, признаны эффективными биологическими средствами борьбы с различными чешуекрылыми вредителями в сельском хозяйстве и лесах. Незрелые стадии потомства Trichogramma развиваются в яйцеклетке хозяина, демонстрируя замечательную миниатюрность (примерно 0,5 мм в длину взрослой особи). Методология РНК-интерференции (РНК-интерференции) стала важнейшим инструментом для выяснения функций генов во многих организмах. Тем не менее, манипулирование РНК-интерференцией у некоторых мелких паразитоидных видов, таких как Trichogramma, в целом представляет значительные проблемы. В данном исследовании мы представляем эффективный метод РНК-интерференции при Trichogramma denrolimi. Описанная процедура включает в себя получение и изоляцию отдельных образцов T. dendrolimi из яйцеклеток хозяина, конструирование и синтез двухцепочечной РНК (дцРНК), трансплантацию in vitro и культивирование куколок T. dendrolimi , микроинъекцию дцРНК и последующую оценку нокдауна гена-мишени с помощью анализа ОТ-кПЦР. Это исследование представляет собой всеобъемлющую, наглядно детализированную процедуру проведения экспериментов с РНК-интерференцией у T. dendrolimi, что позволяет исследователям исследовать регуляцию генов у этого вида. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для исследований РНК-интерференции или микроинъекций у других видов трихограмм с незначительными корректировками, что делает ее ценным справочным материалом для проведения экспериментов с РНК-интерференцией у других эндопаразитических видов.
Introduction
Trichogramma spp. представляет собой группу яичных паразитоидов, которые широко используются в качестве высокоэффективных средств биологической борьбы с широким спектром чешуекрылых вредителей в сельскохозяйственных и лесных экосистемах по всему миру 1,2,3,4. Применение трихограммы массового выращивания обеспечивает экологически чистый подход к устойчивой борьбе с вредителями 5,6,7. Понимание молекулярной биологии ос Trichogramma дает ценную информацию о повышении эффективности массового выращивания и производительности этих агентов биологического контроля в полевых условиях 8,9 путем изучения методологии регуляции генов и редактированиягенома 10.
С момента открытия в 1998 г. двухцепочечной РНК-опосредованной специфической генетической интерференции у Caenorhabditis elegans метод РНК-интерференции (РНК-интерференции) превратился в жизненно важный генетический инструментарий для изучения регуляторных механизмов организмов путем подавления экспрессии генов-мишеней11. Эксперименты с РНК-интерференцией стали стандартной методологией, широко применяемой для изучения функции генов у многочисленных видов насекомых12,13. Тем не менее, манипулирование РНК-интерференцией представляет собой серьезную проблему для многих паразитоидных видов, особенно среди тех, которые принадлежат к эндопаразитическому семейству Chalcidoidea 14,15,16. Метод РНК-интерференции был задокументирован по меньшей мере у 13 паразитоидных видов: 14,15,16,17,18,19. Среди них РНК-интерференционный подход был всесторонне проведен на осах Nasonia и применим на всех стадиях развития, включая эмбрионы, личинки, куколки и взрослых особей 14,15,16. Примечательно, что осы Nasonia являются эктопаразитоидами, их потомство развивается в междоузлиевом пространстве между куколкой-хозяином и пупарием, что позволяет их культивировать in vitro и заставляет их переносить определенные методы лечения, такие как микроинъекции. В отличие от ос Nasonia, особи Trichogramma проходят все свое эмбриональное, личиночное и куколочное развитие внутри яйца хозяина. Слой на стадиях эмбриона и личинки (который может препятствовать проницаемости дцРНК), уязвимость к повреждениям и трудности выживания in vitro представляют собой огромные препятствия 20,21,22. Кроме того, крошечный размер особей Trichogramma, примерно ~0,5 мм в длину взрослой особи или куколки, делает их чрезвычайно сложными для манипулирования 20,21,22.
В настоящем исследовании мы излагаем комплексную процедуру проведения экспериментов по РНК-интерференции (РНК-интерференции) в Trichogramma denrolimi Matsumura. Эта процедура включает в себя следующие процедуры: (1) разработка и синтез двухцепочечной РНК (дцРНК), (2) микроинъекция куколок T. denrolimi, (3) трансплантация и инкубация этих куколок in vitro и (4) обнаружение нокдауна гена-мишени с помощью анализа ОТ-кПЦР. Геном-мишенью, выбранным для эксперимента с РНК-интерференцией, является гомология тяжелой цепи ферритина (Ferhch). ФерГХГ, железосвязывающий белок, содержит феррокидазный центр, наделенный антиоксидантными способностями, облегчая окисление Fe2+ до Fe3+. Он играет незаменимую роль в росте и развитии различных организмов, поддерживая окислительно-восстановительное равновесие и гомеостаз железа. Истощение FerHCH может привести к чрезмерному накоплению железа, что приводит к необратимому повреждению тканей и часто приводит к значительным фенотипическим изменениям, включая дефекты роста, деформации и смертность23,24. Это исследование предлагает пошаговое руководство по проведению РНК-интерференции у T. denrolimi, которое будет иметь неоценимое значение для изучения функций генов в более широком контексте ос Trichogramma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, инструментам, программному обеспечению и реагентам, используемым в этом протоколе.
1. Сбор и поддержание культуры насекомых
- Приклейте группу из ~5 000 яиц Corcyra cephalonica (Stainton) на карту размером 9 см на 16 см, используя раствор 1:5 (v/v) порошка гуммиарабика и воды25,26.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикрепляйте слишком много яйцеклеток хозяина к карте, так как переполненность делает ее непрактичной для последующих процедур переноса и вскрытия. - Чтобы предотвратить вылупление яиц хозяина, подвергните карточки яиц хозяина 30-минутному ультрафиолетовому (УФ) облучению (рисунок 1-i). Затем разрежьте бумагу с инактивированными яйцами на карточки для яиц толщиной 1 см и диаметром 8 см, каждая из которых содержит примерно 300-500 яиц (рис. 1-ii)25,26,27.
- Ввести когорту из 80-120 ос T. denrolimi в стеклянную трубку диаметром 2 см и длиной 8 см. Заклейте трубочку ватой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте ос при температуре 25 ± 1 °C, с циклом света/темноты 16 часов света и 8 часов темноты и поддерживайте относительную влажность около 75%. - Предъявите осам карточку с яйцом хозяина для паразитирования (рис. 1-ii). Дайте осам отложить яйца в яйца хозяина в течение 6 часов, после чего немедленно удалите ос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного удлинения периода паразитирования, так как это может привести к скученности потомства T. denrolimi в яйце хозяина, что приведет к увеличению смертности потомства ос28,29.
2. Синтез дцРНК
- Разработка наборов праймеров, содержащих промотор Т7 для синтеза двухцепочечной РНК (дцРНК). Выберите сегмент длиной 300-400.о. из гена-мишени (Ferhch) для синтеза дцРНК.
- Приобретение коммерчески синтезированных наборов праймеров для производства дцРНК для целевого гена и dsGFP для использования в качестве негативного контроля.
- Извлеките содержание РНК из 100 ос T. denrolimi с помощью указанного набора в соответствии с протоколом производителя9. Проверить качество содержания РНК; продолжить, если значение OD260/OD280 находится в диапазоне от 1,8 до 2,09.
- Очищают содержание РНК 2 мкл 5-кратного буфера (1 U/50 мкл), 1 мкл ДНКазы (1 U/50 мкл) и 6,5 мкл РНК (~100 нг/мкл), 0,5 мклH2Oпри 42 °C в течение 2 мин.
- Проведите полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) для создания матрицы кДНК с 10 мкл очищенной РНК (~100 нг/мкл), 4 мкл 5-кратного буфера (1 U/50 мкл), 1 мкл смеси ферментов I (1 U/50 мкл) и 4 мкл H2O. Выполняйте ОТ-ПЦР со следующиминастройками: 37 °C в течение 15 мин, 85 °C в течение 5 с. Храните продукт кДНК при температуре -4 °C до использования.
- Проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации последовательностей дцРНК в соответствии с эталонной мастер-смесью (10 мкл Taq II [1 U/50 мкл], 0,8 мкл прямого праймера [0,4 мкМ], 0,8 мкл обратного праймера [0,4 мкМ], 0,8 мкл матрицы ДНК [40 нг/мкл] и 7,6 мкл H2O). Выполняйте ПЦР со следующими настройками: 94 °C в течение 2 мин; 35 циклов при 94 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с; 72 °C в течение 2 мин.
- Оценивают качество продуктов ПЦР методом электрофореза на 2,0% агарозном геле 5,9 и подтверждают целевую последовательность с помощью секвенирования по Сэнгеру.
- Очистите продукт ПЦР с помощью набора для экстракции геля в соответствии с рекомендациями производителя 9,23.
- Используйте систему РНК-интерференции для синтеза дцРНК для гена-мишени с 10 мкл 2-кратного буфера (0,02 U/мкл), 8 мкл матрицы ДНК (75 нг/мкл) и 2 мкл смеси ферментов (1 U/50 мкл) со следующими настройками: 37 °C в течение 30 мин, 70 °C в течение 10 мин и 25 °C в течение 20 мин. Элюируют синтезированную дцРНК с помощью 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
- Оценивают качество продукта дцРНК, визуализируя его на 1,0% агарозном геле 5,9. Разбавить дцРНК до 7 000 нг/мкл. Проверить качество продукта дцРНК; продолжить, если значение OD260/OD280 находится в диапазоне от 1,8 до 2,09. Храните продукт дцРНК при температуре -20 °C до использования.
3. Трансплантация куколок T. denrolimi
- Культивировать яйца паразитированных хозяев в течение примерно 8 дней при температуре 25 ± 1°C, поддерживая цикл 16 ч светлый/8 ч темноты и относительную влажность ~75%. Яйца паразитированного хозяина чернеют через 5 дней30 (рис. 1-iv,v).
- Перенесите яйцеклетку хозяина в препарирующий микроскоп. Используйте пару вольфрамовых игл (Рисунок 1-vi), чтобы тщательно удалить хорион из яиц хозяина (Рисунок 1-vii) и извлечь куколку изнутри (Рисунок 1-viii)5,17,18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик иглы для препарирования должен быть менее 0,05 мм. - Подготовьте чистую тарелку для субстрата. Вылейте 10-15 мл 15 г/л раствора агара, дав ему естественным образом остыть (рис. 2-i).
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте раствор агара с 0,5 г стрептомицина, чтобы подавить рост загрязняющих веществ in vitro. - С помощью продезинфицированного гравера протравить несколько канавок глубиной 0,2-0,3 мм и шириной 0,4-0,8 мм (рис. 2-ii).
- С помощью маленькой кисточки (Рисунок 2-III) пересадите куколку из препарированного яйца хозяина в одну из бороздок на агаровом субстрате (Рисунок 2-iv).
- Повторите шаги 3.4 и 3.5, пересаживая 100-300 куколок по отдельности в бороздки одну за другой (рис. 2-v).
4. Микроинъекция дцРНК в куколку T. denrolimi
- Используйте съемник стеклянной иглы, чтобы потянуть стеклянный капилляр (Рисунок 3-i, ii). Установите нагрев на 280, скорость на 170, задержку на 250 и тягу на 30 на съемнике иглы (рис. 3-iii). Подготовьте несколько капиллярных стеклянных игл для микроинъекций (рис. 3-iv, v).
- Скосите кончик стеклянной иглы с помощью абразивной пластины (рисунок 3-vi).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кончик инъекционной иглы остается острым; в противном случае это может привести к падежу куколки или затруднить поток реагента через иглу (рис. 3-vii). - Загрузите примерно 2 мкл раствора для инъекций дцРНК с концентрацией 7 000 нг/мкл в подготовленную инъекционную иглу с помощью микроинжекционного насоса (рис. 3-vii).
- Перенесите агаровую подложку, содержащую сотни куколок, на платформу составного микроскопа (рис. 3-viii).
- Осторожно введите инъекционную иглу в брюшную полость куколки T. denrolimi под углом ~30° к брюшной полости под линзой (рис. 3-ix).
- Постепенно вводите ~5 нл раствора для инъекций (шаг 4.3) в куколку T. denrolimi как можно осторожнее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Куколка T. denrolimi может слегка набухать при введении раствора дцРНК. Введение чрезмерного количества раствора в куколку или использование игл с слишком большими отверстиями может привести к преждевременной гибели куколки. Меняйте иглы, когда они забиваются после введения от нескольких до десятков куколок. - Повторите шаги 4.5 и 4.6, вводя дцРНК в 600 куколок одну за другой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежного анализа ОТ-кПЦР содержание РНК должно быть выделено не менее чем из 100 куколок. Введите не менее 600 куколок для трех репликаций при лечении дцРНК и трех репликатов в отрицательном контроле dsGFP 9.
5. Инкубация куколок T. denrolimi
- Перенесите субстрат, содержащий введенных куколок, в инкубатор при температуре 25 ± 1 °C с циклом свет/темнота 16 ч/8 ч и относительной влажностью ~75%.
- Инкубируйте около 700 T. denrolimi куколок за одну обработку в течение 24 ч или 48 ч. Извлечение содержимого РНК из группы из 100 куколок на репликат9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите сморщенные куколки (мертвые куколки) из образцов; В противном случае это может привести к ошибкам в обнаружении экспрессии генов. - Инкубируйте ~50 T. denrolimi куколок за одну обработку, пока не появятся осы (рис. 3-x). Запишите частоту появления и частоту деформации.
6. Обнаружение целевой экспрессии генов
- Разработайте набор праймеров для гена-мишени и референсных генов для ОТ-кПЦР с помощью инструмента проектирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы последовательности праймеров RT-qPCR не перекрывались с целевым участком дцРНК. - Используйте ген вилочной коробки O (FoxO) в качестве референсного гена в анализе ОТ-кПЦР; ранее сообщалось о праймерах FoxO 9.
- Получение коммерчески синтезированных наборов праймеров. Выполняйте ОТ-кПЦР с 10 мкл Taq II (1 U/50 мкл), 0,8 мкл прямого праймера (0,4 мкМ), 0,8 мкл обратного праймера (0,4 мкМ), 0,8 мкл шаблона (10 нг/мкл) и 7,6 мклH2O. Выполняйте ОТ-кПЦР со следующими настройками: 95 °C в течение 30 с; 35 циклов при 95 °C в течение 5 с, 57 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с; 95 °С в течение 10 с; 60 °C в течение 5 с и 95 °C в течение 5 с.
- Рассчитайте значение экспрессии целевого гена с помощью метода 2-ΔΔCt 9,25.
- Используйте тест Краскела-Уоллиса для анализа экспрессии гена-мишени под влиянием различных методов лечения (dsFerhch, dsGFP, без инъекций).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования параметрических тестов (например, t-критерия) для сравнений post-hoc, так как гетероскедастичность и ненормальность данных могут привести к ошибочным выводам25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Частота появления куколок T. denrolimi , которым вводили dsFerhch, была значительно ниже, чем у тех, кому вводили dsGFP или которым не вводили (табл. 1). Среди появившихся ос у 51,85% ос T. denrolimi , подвергшихся dsFerhch , развились деформированные мелкие крылья. Деформированные осы не наблюдались у ос, которым вводили dsGFP или без инъекций (табл. 1). Кроме того, в брюшной полости куколок T. denrolimi , которым вводили dsFerhch , наблюдался меланизм, который является фенотипом аномального метаболизма железа23. Меланизм не наблюдался у куколок T. denrolimi , которым вводили dsGFP, или у куколок без инъекций (рис. 4).
Анализ ОТ-кПЦР показал, что экспрессия Ferhch в куколках T. denrolimi через 24 ч после инъекции dsFerhch (0,6460 ± 0,0056) была значительно снижена по сравнению с теми, кому вводили dsGFP (1,4514 ± 0,5402; Р = 0,0415). Тем не менее, она существенно не отличалась от экспрессии у куколок без какой-либо инъекции (1,0000 ± 0,1953; Р = 0,8725). Экспрессия ферха у куколок T. denrolimi через 48 ч после инъекции dsFerhch (0,5170 ± 0,0575) была значительно снижена по сравнению с куколками, которым вводили dsGFP (0,8515 ± 0,0233; P = 0,0182) и без инъекций (1,0548 ± 0,3006; P = 0,0113) (рис. 5).
Рисунок 1: Сбор и поддержание культуры Trichogramma denrolimi . (i) Подвергать яйцеклетки хозяина ультрафиолетовому (УФ) облучению. (ii) Разрежьте бумагу с инактивированными яйцами на карточки с яйцами. (iii) Предъявите осам карточку с яйцом хозяина для паразитирования. (iv) Культивируйте яйца паразита-хозяина в течение 8 дней. (v) Яйца паразита-хозяина почернеют через 5 дней. (vi) Игла для препарирования с наконечником 0,04 мм. (vii) Удалить хорион из яиц хозяина. (viii) Куколка T. denrolimi . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Трансплантация и инкубация куколок Trichogramma denrolimi . (i) Агаровый субстрат. (ii) Используйте продезинфицированный гравер, чтобы вытравить несколько канавок на подложке. (iii) Используйте маленькую щетку, чтобы (iv) пересадить куколку из препарированного яйца хозяина в бороздку на субстрате. (v) Пересадка 100-300 куколок по отдельности в бороздки по одной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процедура микроинъекции. (i) Стеклянный капилляр. (ii) Съемник стеклянной иглы. (iii) Настройки иглосъемника. (iv) Подготовьте несколько капиллярных стеклянных игл для микроинъекций. (v) Кончик иглы капиллярного стекла. (vi) Скосите кончик стеклянной иглы с помощью абразивной пластины. (vii) Загрузите примерно 2 мкл раствора для инъекций дцРНК. (viii) Составной микроскоп. (ix) Введите инъекционную иглу в брюшную полость и введите раствор для инъекций. (x) Появление ос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Морфологическая характеристика куколки и осы Trichogramma denrolimi . Куколка и оса, которым вводили dsFerhch , проявляют меланизм с почерневшей окраской тела. У осы, которой ввели dsFerhch , видна пара деформированных маленьких крыльев. Меланизм и деформированные крылья не наблюдаются у куколок и ос, которым вводили dsGFP, а также у куколок без инъекций. Масштабные линейки = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Экспрессия гена-мишени Ferhch по отношению к FoxO через 24 ч и 48 ч после введения dsFerhch илиds GFP или без инъекции. Полосы ошибок указывают на стандартные ошибки. Разные строчные буквы указывают на существенную разницу при P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Переменные | dsFerhch | dsGFP | Без инъекций | χ2 | P |
| Всходы | 54.00% (27/50) б | 78.00% (39/50) А | 90.00% (45/50) А | 17.46 | <.001 |
| Скорость деформации | 51.85% (14/27) А | 0% (0/39) млрд | 0% (0/45) млрд | 49.84 | <.001 |
Таблица 1: Возникновение и деформация Trichogramma denrolimi при инъекциях dsFerhch, dsGFP или без инъекции. Разные строчные буквы указывают на значимые различия в частоте появления всходов при P < 0,05. Различные прописные буквы указывают на значительные различия в частоте деформации при P < 0,05. Значения χ2 и P, указанные в таблице, оцениваются с помощью независимого теста χ2 и указывают на суммарное влияние трех уровней обработки на частоту появления и частоту деформации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Осы трихограммы признаны эффективными средствами биологической борьбы, особенно нацеленными на ряд чешуекрылых вредителей в сельском и лесном хозяйстве1. Эти миниатюрные осы проходят свои незрелые стадии в яйце хозяина, что создает проблемы при проведении экспериментов с РНК-интерференцией 5,18. Данное исследование представляет собой исчерпывающее визуальное руководство по проведению экспериментов с РНК-интерференцией на T. denrolimi. Учитывая общие биологические особенности видов трихограмм, процедура может быть легко адаптирована для исследований РНК-интерференции или микроинъекций у других видов трихограмм и эндопаразитических видов с некоторыми корректировками.
В процедуре используется несколько инновационных подходов, способствующих эффективным микроинъекциям содержимого дцРНК, оптимизации процесса ОТ-кПЦР для T. denrolimi и оптимизации трансплантации и инкубации in vitro куколок T. denrolimi. Согласно этому исследованию, частота появления пересаженных куколок достигала 90% без какой-либо инъекции. Когда трансплантированные куколки подвергались инъекции dsGFP, частота появления этих куколок составила 78% (табл. 1). Успешные эксперименты с РНК-интерференцией при трихограмме в значительной степени зависят от точных микроинъекций и тщательной инкубации куколок in vitro. Восприимчивость изолированных куколок Trichogramma к повреждению во время инъекции может быть вызвана слишком большими иглами для микроинъекций, поспешными методами инъекций или микробным загрязнением агарового субстрата. Представленный здесь детальный визуальный метод также дает представление о технике микроинъекций у T. denrolimi, которая необходима не только для других инструментов генетического редактирования (например, системы CRISPR-Cas9), но и для проведения различных физиологических экспериментов (например, искусственная трансинфекция симбионтов и доставка ингибиторов или активаторов физиологических реакций)1,14,15,16.
Для анализа ОТ-кПЦР в этом исследовании было введено около 1500 куколок. Учитывая небольшой размер T. denrolimi, для обеспечения достаточного качества и количества РНКдля анализа ОТ-кПЦР необходимо не менее 100 куколок на репликат. Следовательно, введение дцРНК в сотни куколок является обязательным. Кроме того, необходимы усовершенствования в процедуре выделения РНК (например, использование специального набора для экстракции РНК, совершенствование программ ПЦР) для получения приемлемого содержания РНК от меньшего числа индивидуумов с трихограммой на репликат. Альтернативный подход предполагает доставку дцРНК путем замачивания или кормления, что может быть более удобным для получения значительного числа индивидуумов, подвергшихся воздействию дцРНК. Кроме того, важно отметить, что нынешняя процедура РНК-интерференции применима только на куколочной стадии T. denrolimi. В будущих исследованиях особое внимание должно уделяться разработке эффективных методов РНК-интерференции для эмбриональных и личиночных стадий15,16.
Таким образом, это исследование очертило эффективный метод РНК-интерференции у T. denrolimi. На протяжении десятилетий функции генов в пределах всего рода Trichogramma редко изучались. Данная методология представляет собой надежную модель для исследования регуляции генов в процессе развития и физиологической активности у ос с трихограммой. Будущие исследования должны сделать акцент на разработке генетических инструментов, таких как редактирование генома и РНК-интерференция у ос с трихограммой. Углубленное изучение молекулярной биологии ос Trichogramma дает ценную информацию для повышения эффективности массового выращивания и производительности этих агентов биологического контроля для борьбы с вредителями в полевых условиях 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось проектами Национального фонда естественных наук Китая (32172476, 32102275), Программой инноваций в области сельскохозяйственной науки и технологий (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) и Центральными фондами, направляющими местное научно-техническое развитие (XZ202301YD0042C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
| Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
| Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
| Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
| Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
| Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
| Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
| Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
| GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
| Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
| Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
| Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
| Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
| Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
| OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
| PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
| Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA |
||
| Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG |
||
| Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC |
||
| Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG |
||
| Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
| Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) |
TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
| Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
| Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
References
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
- Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
- Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
- Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
- Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753 (2023).
- Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).
- Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990 (2017).
- Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892 (2020).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
- Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
- Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).
- Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
- Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
- Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222 (2022).
- Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567 (2019).
- Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
- Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
- Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).
- Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).
