Summary
RNA girişiminin (RNAi) manipülasyonu, Trichogramma yaban arıları gibi küçücük boyuta sahip birçok parazitoid türünde zorlu bir zorluk teşkil eder. Bu çalışma, Trichogramma denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemini tanımlamıştır. Mevcut metodoloji, Trichogramma yaban arılarında gen regülasyonunu araştırmak için sağlam bir model sunmaktadır.
Abstract
Yumurta parazitoitleri, Trichogramma spp, tarım ve ormanlarda çeşitli lepidopteran zararlılarına karşı etkili biyolojik kontrol ajanları olarak kabul edilmektedir. Trichogramma yavrularının olgunlaşmamış aşamaları, konukçu yumurta içinde gelişir ve dikkate değer bir küçülme sergiler (yetişkin uzunluğunda yaklaşık 0,5 mm). RNA-interferans (RNAi) metodolojisi, çok sayıda organizmada gen fonksiyonlarını aydınlatmak için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, Trichogramma gibi bazı küçük parazitoid türlerde RNAi'yi manipüle etmek genellikle önemli zorluklar ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, Trichogramma denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemi sunuyoruz. Ana hatlarıyla belirtilen prosedür, konakçı yumurtalardan bireysel T. dendrolimi örneklerinin elde edilmesini ve izolasyonunu, çift sarmallı RNA'nın (dsRNA) tasarımını ve sentezini, T. dendrolimi pupa'nın in vitro transplantasyonunu ve kültivasyonunu, dsRNA'nın mikro enjeksiyonunu ve ardından RT-qPCR analizi yoluyla hedef gen yıkımının değerlendirilmesini kapsar. Bu çalışma, T. dendrolimi'de RNAi deneyleri yapmak için kapsamlı, görsel olarak ayrıntılı bir prosedür sağlar ve böylece araştırmacıların bu türdeki gen regülasyonunu araştırmasını sağlar. Ayrıca, bu metodoloji, küçük ayarlamalarla diğer Trichogramma türlerinde RNAi çalışmaları veya mikro enjeksiyonlar için uyarlanabilir ve bu da onu diğer endoparazitik türlerde RNAi deneyleri yapmak için değerli bir referans haline getirir.
Introduction
Trichogramma spp. dünya çapında tarım ve orman ekosistemlerinde geniş bir yelpazede lepidopteran zararlılarına karşı yüksek verimli biyolojik kontrol ajanları olarak yaygın olarak kullanılan bir yumurta parazitoidleri grubudur 1,2,3,4. Kitlesel olarak yetiştirilen Trichogramma uygulaması, zararlıların sürdürülebilir yönetimi için çevre dostu bir yaklaşım sağlar 5,6,7. Trichogramma yaban arılarının moleküler biyolojisini anlamak, gen düzenleme ve genom düzenleme metodolojisiniaraştırarak bu biyolojik kontrol ajanlarının 8,9 kütle yetiştirme verimliliğini ve saha performansınıartırmaya yönelik değerli bilgiler sağlar 10.
1998'de Caenorhabditis elegans'ta çift sarmallı RNA (dsRNA) aracılı spesifik genetik girişimin keşfinden bu yana, RNA-girişim (RNAi) yöntemi, hedef genlerin ekspresyonunu baskılayarak organizmaların düzenleyici mekanizmalarını keşfetmek için hayati bir genetik araç setine dönüşmüştür11. RNAi deneyleri, çok sayıda böcek türünde gen fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak uygulanan standart bir metodoloji haline gelmiştir 12,13. Bununla birlikte, RNAi'nin manipülasyonu, birçok parazitoid türde, özellikle endoparazitik Chalcidoidea ailesine ait olanlar arasında zorlu bir zorluk teşkil etmektedir 14,15,16. RNAi yöntemi en az 13 parazitoid türdebelgelenmiştir 14,15,16,17,18,19. Bunlar arasında, RNAi yaklaşımı Nasonia yaban arılarında kapsamlı bir şekilde yürütülmüştür ve embriyolar, larvalar, pupa ve yetişkinler dahil olmak üzere gelişim aşamaları boyunca uygulanabilir 14,15,16. Nasonia yaban arılarının ektoparazitoidler olması, yavrularının konakçı pupa ve puparium arasındaki interstisyel boşlukta gelişmesi, in vitro olarak yetiştirilmelerini sağlayan ve mikro enjeksiyon gibi belirli tedavileri tolere etmelerini sağlayan dikkat çekicidir. Nasonia yaban arılarının aksine, Trichogramma bireyleri tüm embriyonik, larva ve pupa gelişimlerini konakçı yumurtanın içinde geçirirler. Embriyo ve larva aşamalarındaki tabaka (dsRNA geçirgenliğini engelleyebilir), hasara karşı savunmasızlık ve in vitro hayatta kalma zorluğu zorlu engeller sunar 20,21,22. Ek olarak, yetişkin veya pupa uzunluğunda yaklaşık ~ 0.5 mm olan Trichogramma bireylerinin küçültülmüş boyutu, onları20,21,22'yi manipüle etmek için son derece karmaşık hale getirir.
Bu çalışmada, Trichogramma denrolimi Matsumura'da RNA interferansı (RNAi) deneyleri yürütmek için kapsamlı bir prosedürün ana hatlarını çiziyoruz. Bu prosedür aşağıdaki prosedürleri kapsar: (1) çift sarmallı RNA'nın (dsRNA) tasarımı ve sentezi, (2) T. denrolimi pupalarının mikroenjeksiyonu, (3) bu pupaların transplantasyonu ve in vitro inkübasyonu ve (4) RT-qPCR analizi ile hedef gen yıkımının tespiti. RNAi deneyi için seçilen hedef gen, ferritin ağır zincir homolojisidir (Ferhch). Demir bağlayıcı bir protein olan FerHCH, Fe2 + 'nın Fe3 + 'ya oksidasyonunu kolaylaştıran, antioksidan yeteneklere sahip bir ferroksidaz merkezi içerir. Redoks dengesini ve demir homeostazını koruyarak çeşitli organizmaların büyümesinde ve gelişmesinde vazgeçilmez bir rol oynar. FerHCH'nin tükenmesi, aşırı demir birikimine neden olabilir, bu da geri dönüşü olmayan doku hasarına yol açar ve genellikle büyüme kusurları, deformiteler ve mortalite dahil olmak üzere önemli fenotipik değişikliklerle sonuçlanabilir23,24. Bu çalışma, T. denrolimi'de RNAi'yi yürütmek için adım adım bir kılavuz sunmaktadır ve bu, Trichogramma yaban arılarının daha geniş bağlamında gen fonksiyonlarını araştırmak için paha biçilmez olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler, yazılımlar ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Böcek kültürünün toplanması ve bakımı
- ~5.000 yumurtadan oluşan bir grubu Corcyra cephalonica (Stainton) 9:5 (h/h) arap zamkı tozu ve su 25,26 çözeltisi kullanarak 16 cm'ye25,26 cm'lik bir karta yapıştırın.
NOT: Karta çok fazla konakçı yumurta takmaktan kaçının, çünkü aşırı kalabalık sonraki transfer ve diseksiyon prosedürleri için pratik değildir. - Konakçı yumurtaların çatlamasını önlemek için, konakçı yumurta kartlarını 30 dakikalık ultraviyole (UV) ışınlamasına maruz bırakın (Şekil 1-i). Daha sonra, inaktif yumurta içeren kağıdı, her biri yaklaşık 300-500 yumurta içeren 1 cm kalınlığında ve 8 cm çapında yumurta kartlarına kesin (Şekil 1-ii)25,26,27.
- 80-120 T. denrolimi yaban arısı kohortunu 2 cm çapında ve 8 cm uzunluğunda bir cam tüpe yerleştirin. Tüpü pamukla kapatın.
NOT: Yaban arılarını 25 ± 1 °C sıcaklıkta, 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık aydınlık/karanlık döngüsü ile tutun ve yaklaşık %75 bağıl nemi koruyun. - Parazitleştirme için eşekarısına bir konakçı yumurta kartı sunun (Şekil 1-ii). Yaban arılarının yumurtalarını 6 saat boyunca konakçı yumurtalara bırakmalarına izin verin, ardından eşekarısı derhal çıkarın.
NOT: Parazitleşme süresini aşırı uzatmaktan kaçının, çünkü bu, bir konakçı yumurta içinde T. denrolimi yavrularının aşırı kalabalıklaşmasına neden olabilir ve bu da yavru yaban arısı ölümlerinin artmasına neden olabilir28,29.
2. dsRNA'nın sentezi
- Çift sarmallı RNA'nın (dsRNA) sentezi için bir T7 promotörü içeren primer setleri tasarlayın. dsRNA sentezi için hedeflenen genden (Ferhch) 300-400 bp'lik bir segment seçin.
- Hedeflenen gen için dsRNA üretimi için ticari olarak sentezlenmiş primer setleri ve negatif kontrol olarak kullanılmak üzere dsGFP edinin.
- Üreticinin protokolünü izleyerek referans kiti kullanarak 100 T. denrolimi yaban arısındanRNA içeriğini çıkarın 9. RNA içeriğinin kalitesini kontrol edin; OD260/OD280 değeri 1.8 ile 2.09 arasında değişiyorsa devam edin.
- RNA içeriğini 2 μL 5x tampon (1 U/50 μL), 1 μL DNAse (1 U/50 μL) ve 6.5 μL RNA (~100 ng/μL), 0.5 μLH2Oile 42 °C'de 2 dakika boyunca saflaştırın.
- 10 μL saflaştırılmış RNA (~100 ng/μL), 4 μL 5x tampon (1 U/50 μL), 1 μL Enzim Karışımı I (1 U/50 μL) ve 4 μLH2Oiçeren bir cDNA şablonu oluşturmak için ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gerçekleştirin. Aşağıdaki ayarları kullanarak RT-PCR gerçekleştirin: 15 dakika boyunca 37 °C, 5 saniye boyunca 85 °C. cDNA ürününü kullanana kadar -4 °C'de saklayın.
- dsRNA dizilerini referans alınan ana karışıma göre amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin (10 μL Taq II [1 U/50 μL], 0.8 μL ileri primer [0.4 μM], 0.8 μL ters primer [0.4 μM], 0.8 μL DNA şablonu [40 ng/μL] ve 7.6 μLH2O). Aşağıdaki ayarları kullanarak PCR gerçekleştirin: 94 dakika boyunca 2 °C; 30 sn için 94 °C, 30 sn için 60 °C, 30 için 72 °C ile 35 döngü; 72 °C'de 2 dk.
- PCR ürünlerinin kalitesini %2.0 agaroz jel 5,9 üzerinde elektroforez ile değerlendirin ve Sanger dizilimi ile hedef diziyi onaylayın.
- PCR ürününü Jel Ekstraksiyon Kitini kullanarak üreticinin yönergelerinegöre saflaştırın 9,23.
- 10 μL 2x tampon (0.02 U/μL), 8 μL DNA şablonu (75 ng/μL) ve 2 μL enzim karışımı (1 U/50 μL) ile hedef gen için dsRNA'yı sentezlemek için bir RNAi Sistemi kullanın aşağıdaki ayarlarla: 30 dakika boyunca 37 °C, 10 dakika boyunca 70 °C ve 20 dakika boyunca 25 °C. Sentezlenen dsRNA'yı 30 μL Nükleaz İçermeyen Su ile elute edin.
- dsRNA ürününün kalitesini% 1.0 agaroz jeli 5,9 üzerinde görselleştirerek değerlendirin. dsRNA'yı 7.000 ng/μL'ye seyreltin. dsRNA ürününün kalitesini kontrol edin; OD260/OD280 değeri 1.8 ile 2.09 arasında değişiyorsa devam edin. dsRNA ürününü kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
3. T. denrolimi pupalarının nakli
- Parazitlenmiş konukçu yumurtaları yaklaşık 8 gün boyunca 25 ± 1°C'de, 16 saat aydınlık/8 saat karanlık döngü ve ~%75 bağıl nem koruyarak yetiştirin. Parazitlenmiş konakçı yumurtalar 5 günsonra kararacaktır 30 (Şekil 1-iv,v).
- Ev sahibi yumurta kartını bir diseksiyon mikroskobuna aktarın. Koryonu konakçı yumurtalardan titizlikle çıkarmak için bir çift tungsten iğnesi (Şekil 1-vi) kullanın (Şekil 1-vii) ve pupayı içeriden alın (Şekil 1-viii)5,17,18.
NOT: Diseksiyon iğnesinin ucu 0,05 mm'den az olmalıdır. - Alt tabaka için temiz bir plaka hazırlayın. 15 g/L'lik bir agar çözeltisinden 10-15 mL dökün ve doğal olarak soğumasını sağlayın (Şekil 2-i).
NOT: İn vitro kirleticilerin büyümesini engellemek için agar solüsyonunu 0,5 g streptomisin ile karıştırın. - 0.2-0.3 mm derinliğinde ve 0.4-0.8 mm genişliğinde birkaç oluğu aşındırmak için dezenfekte edilmiş bir çakıl taşı kullanın (Şekil 2-ii).
- Kesilen konakçı yumurtadan bir pupayı agar substratındaki oluklardan birine nakletmek için küçük bir fırça (Şekil 2-iii) kullanın (Şekil 2-iv).
- 3.4 ve 3.5 adımlarını tekrarlayın, 100-300 pupa tek tek oluklara tek tek nakledin (Şekil 2-v).
4. dsRNA'nın T. denrolimi pupa'ya mikro enjeksiyonu
- Bir cam kılcal damarı çekmek için bir cam iğne çektirmesi kullanın (Şekil 3-i,ii). Bir iğne çektirmede Isıyı 280'e, Hızı 170'e, Gecikmeyi 250'ye ve Çekmeyi 30'a ayarlayın (Şekil 3-iii). Mikroenjeksiyon için birden fazla kılcal cam iğnesi hazırlayın (Şekil 3-iv,v).
- Aşındırıcı bir plaka kullanarak cam iğnenin ucunu eğimlendirin (Şekil 3-vi).
NOT: Enjeksiyon iğnesinin ucunun keskin kaldığından emin olun; aksi takdirde pupa mortalitesine neden olabilir veya iğneden reaktif akışını engelleyebilir (Şekil 3-vii). - Bir mikro enjeksiyon pompası kullanarak hazırlanan enjeksiyon iğnesine 7.000 ng/μL ile yaklaşık 2 μL dsRNA enjeksiyon solüsyonu yükleyin (Şekil 3-vii).
- Yüzlerce pupa içeren agar substratını bir bileşik mikroskop platformuna aktarın (Şekil 3-viii).
- Enjeksiyon iğnesini dikkatlice bir T. denrolimi pupa'nın karnına, lensin altındaki karına ~30° açıyla yerleştirin (Şekil 3-ix).
- Enjeksiyon çözeltisinin ~ 5 nL'sini (adım 4.3) kademeli olarak T. denrolimi pupa'ya mümkün olduğunca nazikçe enjekte edin.
NOT: T. denrolimi pupa, dsRNA çözeltisi enjekte edildiğinde hafifçe şişebilir. Pupaya aşırı miktarda solüsyon enjekte etmek veya aşırı büyük açıklıklara sahip iğneler kullanmak erken pupa ölümüne neden olabilir. Birkaç ila onlarca pupa enjekte ettikten sonra tıkandıklarında iğneleri değiştirin. - 4.5 ve 4.6 adımlarını tekrarlayın, dsRNA'yı tek tek 600 pupaya enjekte edin.
NOT: Güvenilir RT-qPCR analizi için RNA içeriği en az 100 pupadan izole edilmelidir. DsRNA tedavisinde üç kopya ve dsGFP negatif kontrolündeüç kopya için en az 600 pupa enjekte edin 9.
5. T. denrolimi pupaların inkübasyonu
- Enjekte edilen pupa içeren substratı, 16 saat/8 saat aydınlık/karanlık döngüsü ve ~%75 bağıl nem ile 25 ± 1 °C'de bir inkübatöre aktarın.
- Yaklaşık 700 T. denrolimi pupa'yı tedavi başına 24 saat veya 48 saat inkübe edin. Replikasyon başına 100 pupalık bir gruptan RNA içeriğini çıkarın9.
NOT: Büzülmüş pupaları (ölü pupalar) örneklerden çıkarın; Aksi takdirde, gen ekspresyonunun tespitinde hatalara neden olabilir. - Yaban arıları ortaya çıkana kadar tedavi başına ~ 50 T. denrolimi pupa'yı inkübe edin (Şekil 3-x). Ortaya çıkma oranını ve deformite oranını kaydedin.
6. Hedeflenen gen ekspresyonunun tespiti
- Bir tasarım aracı kullanarak RT-qPCR için hedef gen ve referans genler için primer setini tasarlayın.
NOT: RT-qPCR primerlerinin dizilerinin, dsRNA'nın hedeflenen bölgesi ile örtüşmediğinden emin olun. - RT-qPCR analizinde referans gen olarak gen çatal başı kutusu O (FoxO) kullanın; FoxO'nun primerleri daha öncebildirilmiştir 9.
- Ticari olarak sentezlenmiş primer setleri elde edin. 10 μL Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL ileri primer (0,4 μM), 0,8 μL ters primer (0,4 μM), 0,8 μL şablon (10 ng/μL) ve 7,6 μL H2O ile RT-qPCR gerçekleştirin. Aşağıdaki ayarları kullanarak RT-qPCR gerçekleştirin: 30 saniye boyunca 95 °C; 5 sn için 95 °C, 30 sn için 57 °C, 30 için 72 °C ile 35 döngü; 10 saniye boyunca 95 °C; 5 sn boyunca 60 °C ve 5 sn boyunca 95 °C.
- 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak hedeflenen genin ekspresyon değerini hesaplayın 9,25.
- Farklı tedavilerin (dsFerhch, dsGFP, enjeksiyonsuz) etkisi altında hedef genin ekspresyonunu analiz etmek için Kruskal-Wallis testini kullanın.
NOT: Verilerin heteroskedastisitesi ve normal olmaması hatalı sonuçlara yol açabileceğinden, post-hoc karşılaştırmalar için parametrik testler (örneğin, t-testi) kullanmaktan kaçının25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dsFerhch enjekte edilen T. denrolimi pupalarının ortaya çıkma oranı, dsGFP enjekte edilenlere veya enjeksiyonsuz olanlara göre anlamlı derecede düşüktü (Tablo 1). Ortaya çıkan yaban arıları arasında, dsFerhch'e maruz kalan T. denrolimi yaban arılarının% 51.85'inde deforme olmuş küçük kanatlar gelişmiştir. DsGFP enjekte edilen veya herhangi bir enjeksiyon yapılmayan yaban arılarında deforme olmuş yaban arıları gözlenmedi (Tablo 1). Ayrıca, dsFerhch enjekte edilen T. denrolimi pupalarının karınları, anormal demir metabolizmasının fenotipi olan melanizm sergiledi23. Melanizm, dsGFP enjekte edilen veya herhangi bir enjeksiyon yapılmayan T. denrolimi pupalarda gözlenmedi (Şekil 4).
RT-qPCR analizi, dsFerhch enjeksiyonundan (0.6460 ± 0.0056) 24 saat sonra T. denrolimi pupae'de Ferhch ekspresyonunun dsGFP enjekte edilenlere (1.4514 ± 0.5402; P = 0.0415). Bununla birlikte, herhangi bir enjeksiyon yapılmadan pupalardaki ekspresyondan önemli ölçüde farklı değildi (1.0000 ± 0.1953; P = 0.8725). DsFerhch enjeksiyonundan (0.5170 ± 0.0575) 48 saat sonra T. denrolimi pupae'deki Ferhch ekspresyonu, dsGFP (0.8515 ± 0.0233; P = 0.0182) ve herhangi bir enjeksiyon yapılmamış olanlar (1.0548 ± 0.3006; P = 0.0113) (Şekil 5).
Şekil 1: Trichogramma denrolimi kültürünün toplanması ve bakımı. (i) Ev sahibi yumurta kartlarını ultraviyole (UV) ışınlamasına maruz bırakın. (ii) İnaktif hale getirilmiş yumurtaların bulunduğu kağıdı yumurta kartlarına kesin. (iii) Parazitleme için eşekarısına bir konakçı yumurta kartı sunun. (iv) Parazitlenmiş konakçı yumurtaları 8 gün boyunca yetiştirin. (v) Parazitlenmiş konakçı yumurtalar 5 gün sonra kararır. (vi) 0,04 mm uçlu diseksiyon iğnesi. (vii) Koryonu konakçı yumurtalardan çıkarın. (viii) T. denrolimi pupa. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Trichogramma denrolimi pupaların transplantasyonu ve inkübasyonu. (i) Agar substratı. (ii) Alt tabaka üzerinde birkaç oluk açmak için dezenfekte edilmiş bir çakıl taşı kullanın. (iii) (iv) pupayı disseke edilmiş konakçı yumurtadan alt tabaka üzerindeki bir oyuğa nakletmek için küçük bir fırça kullanın. (v) 100-300 pupanın tek tek oluklara tek tek nakledilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikro enjeksiyon prosedürü. (i) Cam kılcal. (ii) Cam iğne çektirmesi. (iii) İğne çektirmesi ayarları. (iv) Mikroenjeksiyon için birden fazla kılcal cam iğnesi hazırlayın. (v) Kılcal cam iğnenin ucu. (vi) Aşındırıcı bir plaka kullanarak cam iğnenin ucunu eğimlendirin. (vii) Yaklaşık 2 μL dsRNA enjeksiyon solüsyonu yükleyin. (viii) Bileşik mikroskop. (ix) Enjeksiyon iğnesini karın içine sokun ve enjeksiyon solüsyonunu enjekte edin. (x) Yaban arılarının ortaya çıkışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Trichogramma denrolimi pupa ve yaban arısının morfolojik özellikleri. DsFerhch enjekte edilen pupa ve yaban arısı, kararmış vücut rengiyle melanizm sergiler. DsFerhch ile enjekte edilen yaban arısı, bir çift deforme olmuş küçük kanat gösterir. Melanizm ve deforme olmuş kanatlar, dsGFP enjekte edilen veya herhangi bir enjeksiyon yapılmayan pupa ve yaban arılarında gözlenmez. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ds Ferhch veya dsGFP enjeksiyonundan 24 saat ve 48 saat sonra veya enjeksiyonsuz olarak FoxO'ya göre hedef gen Ferhch'in ekspresyonu. Hata çubukları standart hataları gösterir. Farklı küçük harfler, P < 0.05'te önemli bir farkı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Değişken | dsFerhch | DSGFP | Enjeksiyonsuz | χ2 | P |
| Ortaya çıkma oranı | %54.00 (27/50) b | %78.00 (39/50) bir | %90,00 (45/50) bir | 17.46 | <.001 |
| Deformite oranı | %51,85 (14/27) Bir | %0 (0/39) B | %0 (0/45) B | 49.84 | <.001 |
Tablo 1: dsFerhch, dsGFP ile veya enjeksiyonsuz enjekte edilen Trichogramma denrolimi'nin ortaya çıkışı ve deformitesi. Farklı küçük harfler, P < 0.05'te ortaya çıkma oranındaki önemli farklılıkları gösterir. Farklı büyük harfler P < 0.05'te deformite oranında anlamlı farklılıklar olduğunu göstermektedir. Tabloda listelenen χ2 ve P değerleri, χ2 bağımsız testi ile tahmin edilmiştir ve üç tedavi seviyesinin ortaya çıkma oranı ve deformite oranı üzerindeki toplam etkisini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trichogramma yaban arıları, özellikle tarım ve ormancılıkta bir dizi lepidopteran zararlısını hedef alan etkili biyolojik kontrol ajanları olarak kabul edilmektedir1. Bu küçücük yaban arıları, RNAi deneylerinin yürütülmesinde zorluklar sunan bir özellikolan konakçı yumurta içinde olgunlaşmamış aşamalarından geçerler 5,18. Bu çalışma, T. denrolimi'de RNAi deneyleri yapmak için kapsamlı bir görsel rehber sunmaktadır. Trichogramma türleri arasındaki ortak biyolojik özellikler göz önüne alındığında, prosedür, bazı ayarlamalarla diğer Trichogramma türlerinde ve endoparazitik türlerde RNAi çalışmaları veya mikro enjeksiyonlar için kolayca uyarlanabilir.
Prosedür, dsRNA içeriğinin verimli mikro enjeksiyonlarını kolaylaştıran, T. denrolimi için RT-qPCR sürecini kolaylaştıran ve T. denrolimi pupaların transplantasyonunu ve in vitro inkübasyonunu optimize eden çeşitli yenilikçi yaklaşımlar sunar. Bu çalışmaya göre nakledilen pupaların ortaya çıkma oranı herhangi bir enjeksiyon yapılmadan %90'a ulaşmıştır. Nakledilen pupalar dsGFP enjeksiyonuna tabi tutulduğunda bu pupaların çıkma oranı %78 idi (Tablo 1). Trichogramma'daki başarılı RNAi deneyleri, önemli ölçüde hassas mikro enjeksiyonlara ve pupaların in vitro olarak dikkatli bir şekilde inkübasyonuna bağlıdır. İzole Trichogramma pupalarının enjeksiyon sırasında hasara duyarlılığı, büyük boyutlu mikro enjeksiyon iğnelerinden, aceleci enjeksiyon tekniklerinden veya agar substratı üzerindeki mikrobiyal kontaminasyondan kaynaklanabilir. Burada sunulan ayrıntılı görsel yöntem, yalnızca diğer genetik düzenleme araçları (örneğin, CRISPR-Cas9 sistemi) için değil, aynı zamanda çeşitli fizyolojik deneylerin yürütülmesi için de gerekli olan T. denrolimi'deki mikroenjeksiyon tekniği hakkında fikir vermektedir (örneğin, simbiyontların yapay transenfeksiyonu ve fizyolojik yanıtların inhibitörlerinin veya aktivatörlerinin verilmesi)1,14,15,16.
RT-qPCR analizi için bu çalışmada yaklaşık 1.500 pupa enjekte edildi. T. denrolimi'nin küçük boyutu göz önüne alındığında, RT-qPCR analizi için yeterli RNA kalitesi ve miktarını sağlamak için replikat başına minimum 100 pupa gereklidir9. Sonuç olarak, dsRNA'yı yüzlerce pupaya enjekte etmek zorunludur. Ek olarak, replika başına daha az sayıda Trichogramma bireyinden uygun RNA içeriği elde etmek için RNA izolasyon prosedüründe iyileştirmeler (örneğin, belirli bir RNA ekstraksiyon kitinin kullanılması, PCR programlarının rafine edilmesi) gereklidir. Alternatif bir yaklaşım, dsRNA'ya maruz kalan önemli sayıda bireyin elde edilmesi için daha uygun olabilecek ıslatma veya besleme yoluyla dsRNA'nın verilmesini içerir. Ek olarak, mevcut RNAi prosedürünün yalnızca T. denrolimi'nin pupa aşamasında uygulanabilir olduğuna dikkat etmek önemlidir. Gelecekteki araştırmalar, embriyo ve larva aşamaları için verimli RNAi yöntemlerinin geliştirilmesine özel önem vermelidir15,16.
Özetle, bu çalışma T. denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemini tanımlamıştır. Onlarca yıldır, tüm Trichogramma cinsi içindeki gen fonksiyonları nadiren araştırılmıştır. Mevcut metodoloji, Trichogramma yaban arılarında gelişimsel ve fizyolojik aktiviteler sırasında gen düzenlemelerini araştırmak için sağlam bir model sunmaktadır. Gelecekteki araştırmalar, genom düzenleme ve Trichogramma yaban arılarında RNA müdahalesi gibi genetik araçların geliştirilmesini vurgulamalıdır. Trichogramma yaban arılarının moleküler biyolojisinin derinlemesine araştırılması, zararlıların kontrolü için bu biyolojik kontrol ajanlarının toplu yetiştirme verimliliğini ve saha performansını iyileştirmek için değerli bilgiler sunar 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32172476, 32102275), Tarım Bilimi ve Teknoloji İnovasyon Programı (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) ve Yerel Bilim ve Teknoloji Gelişimine Rehberlik Eden Merkezi Fonlar (XZ202301YD0042C) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
| Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
| Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
| Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
| Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
| Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
| Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
| Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
| GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
| Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
| Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
| Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
| Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
| Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
| OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
| PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
| Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA |
||
| Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG |
||
| Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC |
||
| Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG |
||
| Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
| Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) |
TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
| Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
| Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
References
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
- Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
- Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
- Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
- Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753 (2023).
- Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).
- Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990 (2017).
- Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892 (2020).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
- Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
- Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).
- Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
- Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
- Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222 (2022).
- Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567 (2019).
- Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
- Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
- Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).
- Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).
