Summary
基于实时聚合酶链反应 （PCR） 的乙型肝炎病毒 （HBV） DNA 检测和定量是一种诊断和监测 HBV 感染的灵敏且准确的方法。在这里，我们提出了一种用于HBV DNA检测和样本病毒载量测量的方案。
Abstract
乙型肝炎病毒（HBV）是全球肝病的重要原因。它可能导致急性或慢性感染，使个人极易患致命性肝硬化和肝癌。准确检测和定量血液中的HBV DNA对于诊断和监测HBV感染至关重要。检测HBV DNA的最常用方法是实时荧光定量PCR，可用于检测病毒并评估病毒载量，以监测对抗病毒治疗的反应。在这里，我们描述了使用IVD标记的基于实时PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细方案。该试剂盒使用靶向 HBV 基因组高度保守的核心区域的引物和探针，可以准确定量所有 HBV 基因型（A、B、C、D、E、F、G、H、I 和 J）。该试剂盒还包括一个内源性内控品，用于监测可能的PCR抑制。该测定运行 40 个循环，其截止值为 38 Ct。 对于临床样品中 HBV DNA 的定量，试剂盒随附一组 5 种定量标准品。这些标准品包含已知浓度的 HBV 特异性 DNA，这些 DNA 是根据 WHO 第 4个 用于核酸检测的 HBV DNA 国际标准（NIBSC 代码 10/266）校准的。这些标准品用于验证HBV特异性DNA扩增的功能，并生成标准曲线，从而可以定量样品中的HBV DNA。使用PCR试剂盒检测低至2.5 IU/mL的HBV DNA。该试剂盒的高灵敏度和可重复性使其成为临床实验室的强大工具，帮助医疗保健专业人员有效诊断和管理 HBV 感染。
Introduction
乙型肝炎病毒 （HBV） 是一种部分双链 DNA 病毒，来自正肝病毒属和肝萘病毒科 1。它可以引发持续一生的慢性感染，可能导致肝硬化和肝细胞癌 2,3,4。根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，2019 年估计有 2.96 亿人患有慢性乙型肝炎感染，每年有 150 万人新感染5.
血清或血浆样本中HBV DNA的鉴定和测量是检测持续乙型肝炎感染个体、评估抗病毒治疗疗效和预测治疗成功概率的宝贵方法6,7,8,9,10,11。高病毒载量与肝病进展的风险增加有关，包括肝硬化和肝癌12,13。因此，精确测量病毒载量对于跟踪HBV感染的进展和为治疗决策提供信息至关重要。
与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR检测具有更高的灵敏度、更宽的动态范围和更准确的HBV DNA定量14,15,16,17。市场上有几种基于实时荧光定量PCR的商业分子诊断试剂盒，用于定量血清或血浆样本中的HBV DNA。在这里，我们描述了使用市售的、带有IVD标记的基于实时荧光定量PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细工作流程。该试剂盒是一种广泛使用的 18,19、低成本但高灵敏度的检测试剂盒，其性能特征可与其他市售的带有 CE 标志的试剂盒18 相媲美。除了HBV靶区扩增外，试剂盒中还包括一个内源性内控基因，以验证样品质量、提取DNA的质量、PCR扩增和可能的PCR抑制。
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Protocol
这项研究不涉及任何人类参与者或临床样本。唯一使用的生物材料是世卫组织第四条用于核酸检测的HBV DNA国际标准（NIBSC代码10/266）。本标准是公开可用的参考资料，不包含任何个人信息或可识别数据。因此，本研究不需要伦理批准。
1. DNA提取
- 从人血清或血浆样本中提取病毒DNA。将提取的DNA储存在-20°C，直到进一步用于PCR。
注：用于 DNA 提取的推荐血清或血浆体积为 500 μL，洗脱体积为 50 μL。在这项研究中，使用病毒核酸提取试剂盒（材料表）提取病毒DNA。
2. 实时荧光定量PCR
- 在开始PCR之前，在室温（RT;15-25°C）下解冻实时荧光定量PCR试剂盒的所有试剂（表1）。解冻时，通过以中等速度脉冲涡旋 10 秒混合组分，并在室温下以 8,000 × g 离心 15 秒。 将所有解冻的组分放在冷却块上。
- 反应制备
- 根据 表2制备PCR混合物。根据样品数量、标准品和无模板对照计算要添加的试剂的体积。
注意：制备PCR混合物时，应添加每种试剂至少10%的额外体积（例如，如果需要10个反应，则计算11个反应）。 - 将15μL上述制备的PCR混合物移入每个PCR管中。然后，加入 15 μL 提取的样品 DNA。加入 15 μL 至少一种 HBV 标准品（HBV 标准品 1-5）作为检测 HBV DNA 的阳性对照 （PC），加入 15 μL PCR 级无核酸酶水作为阴性对照 （NC）。要生成定量HBV DNA所需的标准曲线，请使用试剂盒随附的所有5种定量标准品（HBV标准品1-5）进行每次PCR运行。
- 关闭试管，通过脉冲涡旋以中等速度混合组分10秒，并在室温下以8,000× g 离心15秒，然后进入热循环仪。确保反应混合物中没有气泡，因为它可能会干扰荧光检测。
- 根据 表2制备PCR混合物。根据样品数量、标准品和无模板对照计算要添加的试剂的体积。
- 程序设置
- 按照 表3中的建议，使用循环条件对PCR仪进行编程。
- 通道/荧光基团选择
- 为常用的实时荧光定量PCR平台选择荧光染料，如 表4所示。
- 数据分析
- 运行完成后，线性刻度分析扩增图。
- 阈值设定
- 在PCR反应的指数阶段设置阈值。 表 5 中提到了该套件的推荐阈值。与阈值设置一致。一旦确定了测定的最佳阈值，就将其一致地用于特定PCR仪的所有样品。这将有助于确保结果的准确性和可重复性。
注意： 如果阈值设置得太低，信号可能低于噪声水平，Ct 值将不可靠。如果阈值设置得太高，则信号可能处于反应的平台期，放大效率不高，Ct值可能不准确。
- 在PCR反应的指数阶段设置阈值。 表 5 中提到了该套件的推荐阈值。与阈值设置一致。一旦确定了测定的最佳阈值，就将其一致地用于特定PCR仪的所有样品。这将有助于确保结果的准确性和可重复性。
- 近路
- 运行试剂盒 40 个扩增周期。不要考虑任何超过 38 个周期的放大进行任何解释。
- 定性结果分析
- 使用该试剂盒对HBV DNA进行定性检测。使用标准 2 作为 PC，HBV 的预期 Ct 值为 20 ± 2，IC 的 Ct 值为 24 ± 3。
- 确保无模板对照 （NTC） 对 HBV 和内部对照 （IC） 靶标均未表现出任何扩增。如果在NTC反应中发生扩增反应，则可能发生了样品污染。
- 由于测定临界值为 38，因此考虑在 38 Ct 之前将 HBV 靶标作为 HBV 阳性样品进行任何扩增。当所有对照都满足上述要求时，考虑按照 表6中提到的解释进行试样。
- 定量结果分析
- 使用已知浓度的 5 种 HBV 特异性 DNA 定量标准品，这些标准品根据 WHO 第 4 个核酸扩增技术 HBV DNA 国际标准 （NAT）20 进行校准（表 7）。
- 使用这些标准来生成标准曲线。利用标准曲线定量未知样品的HBV DNA。
注：实时荧光定量PCR软件将使用所有5种标准的HBV靶标获得的Ct值及其相应的浓度（以国际单位/微升（IU / μL）为单位）生成标准曲线。 - 仅当标准品斜率在-3.1和-3.6之间，R2 值在0.99和1.0之间，PCR效率在90%-110%（0.9-1.1）之间，并且阴性对照中没有扩增时，才解释未知样品的值。
- 该软件将以国际单位/微升 （IU/μL） 计算每个 HBV 阳性样本的浓度。要计算病毒载量（IU/μL 转换为国际单位/毫升 [IU/mL]），请使用以下公式：
结果 （IU/mL） = （结果 [IU/μL] x 洗脱体积 [μL]）/样品体积 （mL）
注：从0.5 mL血浆中提取第4个WHO国际标准HBV DNA，NIBSC代码10/266用于病毒DNA纯化，将纯化的病毒DNA洗脱到50μL洗脱缓冲液中，并与PCR试剂盒一起用作参考样品以及5种HBV标准品和NTC。参考样品（NIBSC 代码 10/266）的 HBV 病毒载量计算为 （6659 IU/μL x 50 μL）/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL。
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Representative Results
从人血浆/血清中检测和定量HBV DNA的工作流程示意图如 图1所示。HBV 和 IC 的标准 2（用作 PC）和 NTC 的扩增曲线如 图 2 所示。 图3 显示了HBV阳性样本、HBV阴性样本和PCR抑制样本的扩增曲线。图 4显示了HBV的扩增曲线、Ct值和获得的HBV浓度（以国际单位/微升（IU/μL）为单位，NIBSC代码为10/266。 图5显示了试剂盒中所有5种HBV标准品的HBV靶标的扩增曲线及其具有代表性的标准品曲线。标准曲线的斜率为-3.361，R2 为0.99996，效率为0.98。所有 5 种 HBV 标准品的 IC 靶标的扩增曲线如 图 6 所示。
图 1：检测和定量人血浆/血清样本中 HBV DNA 的工作流程示意图。 从HBV疑似个体的人血清/血浆样本中提取病毒DNA。通过添加除模板DNA/标准品以外的每种PCR组分来制备PCR混合物。将其分配到PCR管/孔中。加入提取的病毒DNA/标准品作为模板DNA，并关闭PCR管。将其加载到实时荧光定量PCR仪中，开始PCR运行，并在运行完成后分析结果。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：标准 2（用作 PC）和 NTC 的扩增曲线。 这里显示了HBV标准品2的HBV和IC靶标的扩增图。对于定性结果分析，标准 2 可用作阳性对照。对于NTC，两个靶标均未观察到扩增。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：HBV 阳性样本、HBV 阴性样本和 PCR 抑制样本的扩增图。 此处显示了三种不同样品的扩增图：HBV 阳性（病例 1）、HBV 阴性（病例 2）和含有 PCR 抑制剂的样品（病例 3）。在HBV阳性样本的情况下，两个靶标都被扩增，而HBV阴性样本仅扩增了IC，而HBV靶标没有像预期的那样被扩增。对于病例 3，HBV 和 IC 均未扩增，这意味着由于用作 PCR 模板的 DNA 样品中存在 PCR 抑制剂，因此发生了 PCR 抑制。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：扩增曲线、HBV 的 Ct 值以及获得的 NIBSC 代码 10/266 的 HBV 浓度 （IU/μL）。 提取的 NIBSC 代码为 10/266 的病毒 DNA 与 5 种 HBV 标准品和 NTC 一起运行。上图显示了 NIBSC 代码 10/266 样品的 HBV 靶标扩增曲线。其对HBV的Ct值为18.94，计算浓度为6659 IU/μL，如下图所示。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：所有 5 种 HBV 标准品的 HBV 靶标扩增曲线和标准曲线。 所有 5 种 HBV 标准品的 HBV 靶标（绿色通道）的扩增曲线如上图所示。标准曲线及其斜率 （3.361）、R2 值 （0.99996） 和 PCR 效率 （0.98） 显示在下图中。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：所有 5 种 HBV 标准品的 IC 靶标的扩增曲线。 此处显示了 IC（黄色通道）的 5 种 HBV 标准品的扩增曲线。正如预期的那样，它们看起来相同，但 Ct 值相似。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：所有 5 种 HBV 标准品和 NTC 的 HBV 靶标扩增曲线一式三份。 5 种 HBV 标准品的 HBV 靶标（绿色通道）的 3 次重复扩增图显示出相似的结果。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：NIBSC 代码 10/266、NIBSC 代码 14/198 及其五种稀释液的 HBV 靶标的扩增曲线。 参考样品 NIBSC 代码 10/266、NIBSC 代码 14/198 及其五种稀释度（1.25 IU/mL、2.5 IU/mL、5 IU/mL、25 IU/mL 和 50 IU/mL）的 HBV 靶标（绿色通道）的扩增曲线如下所示。1.25 IU/mL未检测到扩增，而其他稀释液在38 Ct之前显示出适当的扩增 曲线。
| 试剂 | 描述 |
| 多路复用预混液 | PCR缓冲液、热启动Taq DNA聚合酶和其他PCR组分 |
| HBV引物探针混合物 | 用于HBV检测的引物和探针混合物 |
| 内源性 IC 引物探针混合物 | 用于内源性内控 （IC） 检测的引物和探针混合物 |
| 乙型肝炎病毒标准品 | · 乙型肝炎病毒标准品1 |
| · 乙型肝炎病毒标准品 2 | |
| · 乙型肝炎病毒标准品 3 | |
| · 乙型肝炎病毒标准品 4 | |
| · 乙型肝炎病毒标准品 5 | |
| 阴性对照 | PCR级无核酸酶水 |
表1：实时荧光定量PCR试剂盒随附的试剂及其描述
| 试剂 | 每次反应的体积 |
| 多路复用预混液 | 11 微升 |
| HBV引物探针混合物 | 2 微升 |
| 内源性 IC 引物探针混合物 | 2 微升 |
| 总反应体积 | 15 微升 |
表2：PCR混合物制备时每次反应要添加的每种试剂的体积
| 步 | 温度 （°С） | 时间 | 数据采集 | 周期 |
| 初始变性 | 94 | 10 分钟 | - | 1 |
| PCR循环 | 94 | 15 秒 | - | 40 |
| 55 | 60 秒 | 上 | ||
| 72 | 15 秒 | - |
表3：PCR循环条件
| 目标 | Rotor-Gene Q实时荧光定量表* | CFX 96型 | ABI实时荧光定量PCR# |
| 乙型肝炎病毒 | 绿 | 家庭 | 家庭 |
| 集成电路 | 黄色 | 十六进制 | 维克 |
| *自动增益优化设置 - 选择“在第一次采集之前执行优化” | |||
| #仅适用于 Applied Biosystems 的实时荧光定量 PCR 仪，在孔板设置过程中选择 ROX 作为“被动参比”染料，因为试剂盒的预混液中含有 ROX | |||
表4：不同实时荧光定量PCR平台的染料选择
| 实时荧光定量PCR仪 | 染料 | 阈值范围§ |
| ABI实时荧光定量PCR¶ | 家庭 | 0.2–0.25 |
| 维克 | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | 家庭 | 100–800 |
| 十六进制 | 50–400 | |
| Rotor-Gene Q实时荧光定量 | 绿 | 0.015–0.03 |
| 黄色 | 0.01–0.02 | |
| §绝对阈值因仪器而异，具体取决于仪器的使用年限、型号和校准状态 | ||
| ¶当选择ROX作为“被动参比”染料时，这些阈值适用 | ||
| †当使用 Bio-Rad 的白色 PCR 管代替透明管时，相对荧光增加约 2 至 5 倍。因此，应相应地确定阈值 | ||
表5：不同实时荧光定量PCR平台的推荐阈值
| 样品类型 | 箱 | 放大信号输入 | 结果解释 | |||
| FAM/绿色 | HEX/VIC/黄色 | |||||
| 控制 | 标准 2/PC | 是 （20 ± 2） | 是 （24 ± 3） | 标准 2/PC 工作正常 | ||
| NTC系列 | 不 | 不 | NTC 工作正常 | |||
| 样本 | 1 | 是的 | 是/否* | 检测到HBV特异性DNA | ||
| 2 | 不 | 是的 | 未检测到HBV特异性DNA。样品不含可检测量的 HBV 特异性 DNA | |||
| 3 | 不 | 不 | 可能抑制PCR，稀释DNA样品（1：10）/从原始样品中重新提取DNA并重复PCR | |||
| *当检测到HBV靶标时，不需要检测内部控制。样品中的高HBV DNA载量可导致内部控制信号减少或缺失 | ||||||
表6：含有劣质样品的阳性、阴性和PCR抑制剂的结果解释
| 标准 | 浓度 （IU/μl） | 所需 Ct | |
| 乙型肝炎病毒 | 集成电路 | ||
| （FAM/绿色） | （HEX/VIC/黄色） | ||
| 乙型肝炎病毒标准品1 | 5 x 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| 乙型肝炎病毒标准品 2 | 5 x 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| 乙型肝炎病毒标准品 3 | 5 x 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| 乙型肝炎病毒标准品 4 | 5 x 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| 乙型肝炎病毒标准品 5 | 5 x 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
表7：HBV标准品及其浓度的HBV目标值和所需Ct值
| 样本 | 预期 Ct | 获得 HBV 的 Ct | 平均 Ct | 标准差 | CV % | ||
| 复制 1 | 复制 2 | 复制 3 | |||||
| 乙型肝炎病毒标准品1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| 乙型肝炎病毒标准品 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| 乙型肝炎病毒标准品 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| 乙型肝炎病毒标准品 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| 乙型肝炎病毒标准品 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
表 8：获得 5 种 HBV 标准品的 Ct 值、平均值、标准偏差和变异系数 （CV%）。
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Discussion
根据供应商信息21，NIBSC 代码 10/266 在 0.5 mL 无核酸酶水中复溶时，单位为 9,55,000 IU/mL。这可以被认为是高负荷HBV阳性样本。本研究中使用的病毒载量试剂盒测定的HBV病毒载量为6,65,900 IU/mL（图4）。由于任何DNA提取试剂盒的DNA提取效率都不是100%，因此在纯化过程中经常会丢失一些DNA。尽管试剂盒确定的病毒载量略低于试剂（NIBSC 代码 10/266）供应商的指定值，但数据仍然令人满意，因为两个值之间的 log10 差异仅为 0.157，小于临界值 （0.5）22。
该协议中使用的病毒载量试剂盒具有高度稳定性，可提供可重复的数据，如 图7所示。在本实验中，所有 5 个标准品和 NTC 一式三份运行，其 Ct 值、平均值、标准偏差和变异系数 （CV%） 如 表 8 所示。如 表8所示，低于1%的CV%表明实验更可靠，并产生高度准确的结果。
该套件使用极低负载参考样品（NIBSC 代码：14/198）23 来检查其 LoD。根据供应商信息，NIBSC 代码 14/198 含有的 HBV DNA 含量低于 50 IU/mL。从NIBSC编码14/198中提取DNA，并制备DNA的多次稀释液（1.25 IU/mL、2.5 IU/mL、5 IU/mL和25 IU/mL）。该试剂盒使用所有稀释液和 5 种 HBV 标准品作为模板 DNA。据观察，该试剂盒可以检测所有稀释度高达 2.5 IU/mL 的 HBV DNA（图 8），并且它与病毒载量试剂盒的 LoD 完全匹配。因此，病毒载量试剂盒是一种高度敏感和可重复的工具，分子诊断实验室可以使用它来帮助医疗保健专业人员有效地诊断和管理HBV感染。
用户在执行该过程时应牢记以下关键步骤。用户必须仅使用提取的高质量DNA作为PCR模板，以确保结果准确。重要的是要避免试剂的多次冻融循环（不超过 3 次）。PCR混合物不应长时间暴露在光线下，因为它含有光敏荧光探针和被动参比染料ROX。在每次运行中始终不包含模板控制和标准品至关重要，以确保结果的准确性和可靠性。必须始终使用带有无菌过滤吸头的校准移液器。模板DNA和标准品必须使用与反应制备区域不同的移液器添加到单独的区域，以避免交叉污染。
以下是基于实时荧光定量PCR检测和定量乙型肝炎病毒DNA的一些常见故障排除技巧。阴性对照中的扩增信号可能由于反应设置过程中的交叉污染而发生。因此，用户应检查套件组件是否受到污染。由于以下原因，可能无法出现标准品的扩增信号：（i） 使用不正确的PCR混合物。用户应检查是否正确添加了所有成分。 （ii） 使用过期试剂。在设置反应之前，用户必须检查有效期。（iii） 试剂储存不当。确保试剂储存在-20°C或以下，并且在反应设置过程中不要长时间保持在室温下。（iv） 使用了错误的PCR循环条件。在这种情况下，建议使用正确的程序重复PCR。（iv） 由于样品中的HBV载量高和PCR抑制，可能会出现样品内部对照信号微弱或无信号。用户可以稀释 DNA 样品 （1：10） 并重复检测样品中的高 HBV 载量。在PCR抑制的情况下，必须用优质试剂重新提取样品DNA，并且必须重复测定。
基于实时荧光定量PCR的乙型肝炎病毒DNA检测和定量是一种非常灵敏和特异性的技术，但它确实存在一些局限性，如成本和复杂性。实时荧光定量PCR仪器和试剂可能很昂贵，而且检测成本可能成为某些患者和医疗保健系统的障碍。实时荧光定量PCR是一项复杂的技术，需要训练有素的人员进行检测并解释结果。它是病毒载量的间接测量，因此标准品和模板DNA的质量都可能影响结果。HBV的新基因型和/或引物-探针区域的突变可能导致假阴性结果。
基于实时荧光定量PCR的HBV DNA检测和定量是一种高灵敏度和特异性的方法，可以检测低水平的病毒DNA。与血清学检测（ELISA和侧向层析测定）等其他方法相比，实时荧光定量PCR具有多个优势。首先，它比血清学检测更敏感。其次，它可以量化样本中存在的HBV DNA的量，而血清学检测只能提供定性结果。最后，与血清学检测相比，实时荧光定量PCR更不容易出现假阳性24。总体而言，实时荧光定量PCR是可用于检测和定量HBV DNA的最灵敏、特异性和定量方法。它也是一种相对较快的技术，非常适合临床使用。
基于实时荧光定量PCR的乙型肝炎病毒DNA检测和定量是一种强大的工具，具有多种未来应用，包括开发新的抗病毒疗法和即时检测。该技术可用于筛选新的抗病毒药物，并在临床试验中监测这些药物的疗效。这可能导致开发更有效和毒性更小的HBV感染治疗方法。实时荧光定量PCR仪器变得越来越小，越来越便携，因此可以在护理点进行HBV病毒载量检测。这可以改善检测的可及性，并导致HBV感染的早期诊断和治疗。这种基于实时荧光定量PCR的试剂盒可与数字PCR进行绝对定量调整，从而更准确地监测样品瓶上样量。
除了这些特定应用外，基于实时荧光定量PCR的HBV DNA检测和定量可能在预防、诊断和治疗HBV感染的新工具和策略的研究和开发中发挥重要作用。
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Disclosures
作者与本研究中使用的HBV病毒载量试剂盒的制造商Kilpest India Limited有关。
Acknowledgments
我们感谢 Praveen、Kusum、Chandan、Isha、Rashmi、Babli、Shivani、Ankita 和 Shikha 提供的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
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