Summary
En este trabajo se describe el uso de un método de flotación para identificar Toxocara canis y Ancylostoma spp. detectados en muestras fecales colectadas de perros en México de 2017 a 2021 en condiciones de campo.
Abstract
El diagnóstico de parásitos caninos con potencial zoonótico como Toxocara canis y Ancylostoma caninum en condiciones de campo suele ser difícil debido al acceso limitado a un laboratorio en zonas rurales y suburbanas de México. Este estudio tuvo como objetivo detectar T. canis y Ancylostoma spp. en muestras fecales colectadas de perros en México de 2017 a 2021 en condiciones de campo. El cálculo del tamaño de la muestra dio como resultado una inscripción objetivo de 534 perros en todo el país.
Las muestras se recogieron directamente del recto o del suelo después de la defecación. Las muestras se almacenaron en bolsas de plástico individuales, herméticamente cerradas, a 4 °C. Se preparó una solución saturada de cloruro de sodio (gravedad específica [SpG] 1,20) tanto en condiciones de campo como de laboratorio. Dentro de los 3 días posteriores a la recolección, se analizaron de 2 a 4 g de heces para detectar parásitos utilizando un método de flotación suspendiendo cada muestra fecal en una solución salina. Las heces se mezclaron con la solución de flotación y se trituraron con una cuchara de metal.
Una vez que se logró una consistencia uniforme, la muestra fecal se vertió en un nuevo vaso de plástico con un colador y se dejó reposar durante 10-15 minutos. Se recogieron tres gotas de la parte superior de la mezcla utilizando un asa de inoculación esterilizada. Los portaobjetos se colocaron en el microscopio y los parásitos fueron identificados por parasitólogos capacitados. Las muestras fecales de 1.055 perros se examinaron microscópicamente. El número de muestras positivas para Ancylostoma spp. fue de 833 (78,95% de frecuencia) y de 222 (21,04%) para T. canis. Estos hallazgos ilustran la importancia de identificar helmintos zoonóticos en perros que viven en zonas urbanas y rurales de México utilizando una técnica coproparasitoscópica en laboratorio y en condiciones de campo.
Introduction
Los parásitos gastrointestinales son uno de los problemas de salud más comunes que afectana los perros. Las estimaciones sugieren que hay ~ 700 millones de perros domésticos en todo el mundo, y aproximadamente 175 millones pueden clasificarse como vagabundos2. Más de 60 especies deparásitos son compartidas entre perros y humanos, lo que sugiere que los perros podrían ser una fuente de infección para los humanos con estos parásitos. Toxocara canis y Ancylostoma caninum son dos especies parásitas que infectan a los perros y, accidentalmente, a los huéspedes humanos. Actualmente, existen varios estudios sobre los lugares donde estos helmintos son capaces de sobrevivir y reproducirse en México. La prevalencia de Toxocara en perros varía de 0% a más de 87% en los Estados Unidos, México, América Central y el Caribe4. Toxocara canis y Ancylostoma spp., así como otras especies parasitarias en perros, han sido reportadas previamente en México 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabla 1).
| Especies parásitas | Región | Prevalencia (%) | Referencia |
| Ancylostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Ooquistes coccidiales | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocefálidos | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Tenias | Baja California | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabla 1: Prevalencia regional (%) de parásitos caninos en México de 2001 a 2020. Los hallazgos de investigaciones previas realizadas entre 2001 y 2020 han permitido identificar la distribución del parásito canino en varios entornos urbanos y rurales de México. Estos estudios proporcionan una comprensión profunda de los elementos epidemiológicos que conducen a la persistencia de parásitos caninos en diferentes ecosistemas, contribuyendo a una evaluación integral del impacto zoonótico de algunas especies de parásitos.
Las etapas del ciclo de vida de los parásitos intestinales, como huevos, quistes, ooquistes o larvas, se pueden encontrar en muestras de heces. Por lo tanto, el examen de la materia fecal proporciona información valiosa sobre los parásitos de un animal. La necesidad de un método para detectar huevos de Ancylostomidae en heces humanas llevó al uso del frotis fecal simple en 1878, que se utilizó durante muchos años para detectar parásitos gastrointestinales, pero se consideró poco sensible. Por lo tanto, surgió la necesidad de desarrollar mejores métodos copromicroscópicos14. Han pasado más de 100 años desde que se describió por primera vez la técnica de flotación para recuperar y contar huevos de parásitos en muestras fecales15. Desde entonces, varios métodos y variantes de la técnica de flotación se han considerado un estándar para la detección de algunos parásitos en sus huéspedes.
Por ejemplo, Lane describió un método en 1924 que involucra la técnica de flotación centrífuga directa, que integra la centrifugación seguida de la flotación del sedimento en una solución saturada de cloruro de sodio con SpG 1.2 en 1 g (Lane) o 10 g (modificación de Stoll). Posteriormente, se modificó la técnica de flotación mediante el uso de soluciones con diferentes SpG14. En 1939, Gordon y Whitlock informaron de las desventajas de la técnica de Stoll debido a la interferencia de los detritos en la visualización de los huevos de parásitos y desarrollaron el método cuantitativo conocido como McMaster16. En 1979, O'Grady y Slocombe demostraron que la gravedad específica de la solución, el tiempo y el tamaño de la malla de los filtros afectan la precisión de la detección de huevos utilizando la técnica de flotación17. Durante las últimas décadas, debido a que se han realizado varias modificaciones en la técnica de flotación, existe una necesidad urgente de estandarizar los métodos de flotación. Actualmente, la detección de infecciones por helmintos caninos en el contexto de la prevención de parásitos zoonóticos es necesaria para aplicar tratamientos antihelmínticos apropiados para limitar la contaminación ambiental con estadios infecciosos de nematodos zoonóticos18.
Entre los métodos cualitativos, la técnica de flotación fecal es ampliamente utilizada y aceptada porque no requiere mucho equipo, es simple, económica y reproducible; Sin embargo, tiene un gran inconveniente y es que carece de sensibilidad cuando la intensidad de la infección es baja19. La capacidad de revelar la presencia de un mayor número de elementos parásitos como huevos, ooquistes, quistes o larvas de nematodos suele estar determinada por la densidad de la solución20.
Informes previos han comparado técnicas coproparasitológicas para la detección de huevos de nematodos caninos. Con respecto a la detección de protozoos móviles, se utilizan frotis fecales directos; mientras que los métodos de sedimentación son útiles para el diagnóstico de huevos pesados de parásitos como los trematodos21. Una de las pruebas diagnósticas de campo más utilizadas es el método del frotis fecal. Sin embargo, el bajo nivel de sensibilidad de esta técnica puede atribuirse al hecho de que contiene residuos que interfieren con la detección de huevos de parásitos. Al incorporar un paso de tamizado junto con soluciones que proporcionan la SpG adecuada, el método de flotación ofrece una observación más clara y menos desordenada de los huevos de ascáridos y anquilostomas. Esto conduce a un proceso más preciso y eficiente para el cribado microscópico22. Asimismo, las técnicas de flotación simple y flotación centrífuga directa se utilizan con mucha frecuencia para recuperar huevos y ooquistes de parásitos14. Los métodos clásicos de flotación pueden considerarse cualitativos o cuantitativos dependiendo del uso de una cámara de conteo como el método McMaster15. No obstante, dado que la técnica de flotación tiene una baja sensibilidad y se centra en la detección de parásitos en el período de la patente, los resultados negativos no deben considerarse concluyentes. Sin embargo, la precisión no solo depende del procedimiento de conservación de las muestras fecales o de la SpG de las soluciones de flotación, sino que también depende de la competencia técnica y la experiencia en la realización de exámenes fecales del usuario.
En consecuencia, se han explorado otros métodos para la detección de parásitos caninos en las heces. En general, se ha reconocido que uno de los enfoques más utilizados para el diagnóstico de las infecciones por helmintos intestinales en perros es la técnica FLOTAC, un método multivalente, sensible y preciso que produce resultados precisos y fiables para el diagnóstico de A. caninum en perros en comparación con un protocolo de flotación en un tubo y la técnica McMaster19. Artículo 23. Los métodos de sedimentación son útiles para recuperar huevos de trematodos, huevos de nematodos embrionados y la mayoría de los huevos de tenia, que no se pueden recuperar en la superficie de una solución de flotación porque estas estructuras no flotan24. Un método que ha demostrado ser superior a las técnicas de flotación/sedimentación es el método de flotación centrífuga doble modificada, ya que permite la detección de huevos de cestodos en las heces, consume menos tiempo, separa los huevos de Anoplocephala de los desechos fecales y disminuye la cristalización25. Además, esta técnica se ha utilizado con éxito para detectar huevos de ascáridos con alta sensibilidad26. Sin embargo, algunas de estas técnicas y métodos centrífugos antes mencionados, como el Ovassay, a diferencia del protocolo de flotación que proponemos en este estudio, requieren la preservación de la muestra en reactivos como el formol, kits comerciales, el procesamiento de muestras en condiciones de laboratorio y el uso de reactivos como el sulfato de zinc27, que son costosos y requieren procedimientos especiales de eliminación para evitar la toxicidad ambiental.
Recientemente se ha favorecido el uso de técnicas que aumenten la sensibilidad del método de flotación mediante la adición de soluciones con alta SpG. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la desventaja de estas soluciones es el aumento de los residuos en la preparación final y, por tanto, la detección inexacta de los huevos del parásito. Además, la disponibilidad comercial de materiales, reactivos, costos, problemas de impacto ambiental y dificultad de uso de métodos centrífugos afectan la selección de una técnica de flotación14, lo que puede ser desafiante en condiciones de campo en contraste con el protocolo que presentamos en este trabajo. La preparación de las soluciones de flotación con sal de mesa es ventajosa sobre la utilización de azúcar porque en condiciones de campo, el azúcar atrae insectos como avispas y abejas y las preparaciones se vuelven pegajosas. Además, soluciones como el fenol, que se agrega a las soluciones de azúcar para evitar la pegajosidad, o el ZnSO4son complejas de desechar adecuadamente de acuerdo con las pautas de protección ambiental y no se pueden desechar en el campo; a diferencia de una solución de sal de mesa.
El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos para detectar huevos de T. canis y Ancylostoma spp. en muestras fecales utilizando una adaptación de la técnica de flotación simple en condiciones de campo y laboratorio. Siguiendo el protocolo aquí descrito y utilizando un microscopio con batería de respaldo, el diagnóstico de estos parásitos zoonóticos caninos en zonas rurales y suburbanas es posible cuando no se dispone de equipos e infraestructura de laboratorio. El método de flotación simple descrito en este trabajo puede proporcionar resultados rápidos y es una técnica no invasiva y rentable para el cribado rutinario.
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Protocol
El uso y cuidado de los perros fue aprobado por la Universidad Nacional y Autónoma de México.
1. Recogida de muestras fecales
NOTA: Manipule al perro con la ayuda de un veterinario o del dueño del animal.
- En el caso de perros asilvestrados (Figura 1A) o animales nerviosos, recoja muestras del suelo inmediatamente después de la defecación o no más de 10 minutos después.
- Lubrique los guantes quirúrgicos o las bolsas de polietileno de paredes delgadas con agua o vaselina. Para recolectar muestras fecales del recto, use guantes quirúrgicos o bolsas de polietileno de paredes delgadas.
- Recoja al menos 2 g de heces de cada perro (Figura 1B).
- Identifique las muestras fecales individuales de la siguiente manera: fecha, ubicación (coordenadas del Sistema de Posicionamiento Global [GPS] utilizando Google Maps), asigne un número de identificación para cada animal, edad aproximada del perro, sexo del perro, raza, perro de interior o exterior (asilvestrado).
- Cierre las bolsas que contienen la muestra fecal con un nudo apretado. Mantenga las bolsas refrigeradas (4-8 °C) si las muestras de heces no se analizan dentro de las 3-4 h posteriores a la recolección.
2. Preparación de una solución salina saturada para el diagnóstico de campo
NOTA: Si el acceso a una balanza, material de medición, estufas o gas para hervir agua está ausente o limitado, la solución salina saturada se puede preparar fácilmente con agua, sal de mesa común, un vaso de plástico de 12 oz (355 ml) y una botella vacía de plástico de refresco de 1 L.
- Lave bien una botella de refresco vacía de 1 litro. Llena la botella con 1 L de agua.
- Llene un vaso de plástico de 12 onzas con sal de mesa común.
- Transfiere la sal a la botella de refresco.
- Cierre bien la botella de refresco con el tapón de rosca. Agite la solución vigorosamente hasta que la sal ya no se disuelva.
NOTA: Agitar la solución en la botella de refresco hasta la disolución completa de la sal puede tardar hasta 90 minutos.
3. Preparación de una solución salina saturada para diagnóstico de laboratorio
- Pesar 420 g de sal de mesa común.
- Disolver 420 g de sal en 1 L de agua.
- Hervir la solución hasta que no se disuelva más sal.
- Filtre la solución para desechar la sal no disuelta.
- Verifique la concentración de la solución usando un hidrómetro o densitómetro de fluido pesado.
NOTA: La concentración ideal tiene un SpG de 1.20 para lograr mejores resultados (Figura 2A). La capacidad de flotación de un huevo está influenciada por su interacción con la solución, lo que contribuye a la capacidad variable de los huevos para flotar en soluciones con la misma gravedad específica. Por lo tanto, para lograr una recuperación óptima de los huevos, es esencial considerar el rango superior de gravedad específica en la solución de flotación, asegurando que supere el de los elementos parásitos objetivo6.
4. Método de flotación
NOTA: Si las muestras fecales están demasiado secas o duras, macerarlas en un mortero.
- Con una cuchara, coloque aproximadamente 3 g de heces en un vaso de plástico (~8,5 cm de altura y ~5,5 cm de diámetro).
- Añadir 1 mL de la solución salina saturada hasta obtener una pasta.
- Revuelva durante 1 minuto y agregue 100 ml de solución salina saturada.
- Pase esta suspensión a través de un colador de plástico a un segundo vaso de plástico para evitar partículas gruesas (Figura 2B).
- Deje reposar la suspensión durante 15-20 min.
- Coloque un asa de inoculación en una llama durante 1 s para asegurarse de que esté libre de huevos, quistes u ooquistes (Figura 2C).
- Espere 5 s para que el asa de inoculación se enfríe (Figura 2D).
- Tome tres gotas de la superficie de la suspensión con el asa de inoculación. Coloque cada una de las tres gotas por separado en un portaobjetos de vidrio (Figura 2E-G)
NOTA: Asegúrese de que las gotas no estén en contacto entre sí (Figura 2H). - Observar bajo el microscopio con un objetivo de 10x (Figura 2I). Coloque un cubreobjetos si el aumento aumenta a 40x.
- Cuando se observe un resultado positivo en la gota, asigne una cruz (+) en el cuaderno de laboratorio para registrar la presencia de parásitos en el período de patente en sitios aleatorios de la superficie de suspensión fecal.
5. Interpretación del método de flotación
NOTA: Los resultados negativos no son concluyentes.
- Realizar una serie de tres pruebas con muestras de 3 días consecutivos para aumentar la sensibilidad de la prueba.
NOTA: Los resultados positivos indican la presencia de parásitos en el período de la patente.
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Representative Results
En este trabajo se describen los procedimientos de colecta y coproparasitoscopia para la identificación de T. canis y Ancylostoma spp. La razón detrás de la adaptación del método simple de flotación fecal para detectar huevos de helmintos caninos es que esta técnica es rentable ya que las soluciones, el equipo y los materiales son económicos. Por lo tanto, el método tiene una alta capacidad de manejo de muestras, ya que se pueden procesar múltiples muestras en un período corto. Además, el método simple de flotación fecal es fácil de realizar y relativamente sensible.
El tamaño de la muestra y la elección de los animales se realizaron por conveniencia, determinados principalmente por la voluntad del propietario de los animales y la seguridad de los perros asilvestrados que se acercaban. En el presente trabajo se utilizó el método de flotación para evaluar las ocurrencias y frecuencias de Ancylostoma spp. y T. canis en perros Canis lupus familiaris en México durante 4 años a partir de 2017. Se recogieron muestras fecales de 1.638 perros y se analizaron al microscopio. Un total de 1.235 perros fueron positivos para T. canis y Ancylostoma spp. Uno de los objetivos del empleo del método de flotación fue demostrar su efectividad en la medición de la ocurrencia de Toxocara o Ancylostoma, pero también nos propusimos realizar un examen más profundo de los factores que podrían afectar su prevalencia. En consecuencia, se descartaron 185 animales con infecciones mixtas. El número de muestras positivas para Ancylostoma spp. fue de 833 (78,95% de frecuencia) y de 222 (21,04%) para T. canis. De las 1.050 muestras, el 75,5% (793 muestras) se procesaron y leyeron en un entorno de campo mediante la preparación de la solución de flotación con una botella de refresco y el uso de un microscopio con 3 pilas recargables AA de 1,2 V durante 4 h de funcionamiento continuo. Las 257 muestras fecales restantes fueron examinadas en el laboratorio.
Uno de los objetivos de este estudio fue utilizar una solución de flotación y un método en un entorno de campo para acelerar y facilitar el diagnóstico de dos parásitos helmintos de perros en áreas donde no se dispone de infraestructura o equipo de laboratorio. La aplicación en campo del método de flotación nos permitió comunicar los hallazgos a 400 propietarios inmediatamente después de cada lectura microscópica para proporcionar recomendaciones sobre tratamientos antihelmínticos y medidas preventivas y, por lo tanto, evitar la propagación del parásito en humanos o animales de compañía. Asimismo, la técnica de flotación en el campo permitió examinar a los perros asilvestrados y proporcionarles un tratamiento antihelmíntico mediante golosinas o alimentos. La Figura 3A y la Figura 3B muestran huevos de T. canis y Ancylostoma spp., respectivamente, observados después de que la solución de flotación y la técnica se realizaron en un entorno de campo. Cuando las muestras de heces frescas se sometieron al método de flotación en un entorno de campo, la solución preparada en una botella de refresco fue capaz de poner huevos de helmintos en flotación. La producción de cristales de sal y burbujas de aire se comparó con las muestras leídas en un entorno de laboratorio y el operador no detectó ninguna diferencia. Esta observación es alentadora y desafía el conocimiento de que la concentración de muestras fecales garantiza una lectura microscópica más precisa.
Cuando la solución de flotación y las muestras de heces se procesaron en un entorno de laboratorio, no se percibieron diferencias con respecto a la morfología y claridad de las lecturas bajo el microscopio, ya que la misma cantidad de desechos flotó simultáneamente en la detección copromicroscópica de parásitos tanto en el campo como en el laboratorio. La Figura 3A, B muestra los huevos de T. canis y Ancylostoma spp., respectivamente, recuperados de las 257 muestras que se procesaron en un entorno de laboratorio totalmente equipado después del transporte de muestras de áreas urbanas, suburbanas y rurales. Estos huevos de parásitos no difirieron morfológicamente de los observados en condiciones de campo (Figura 3C).
Este protocolo generó un número suficiente de hallazgos para evaluar la influencia de la localización, la estación del año, el sexo, la raza, la edad y las condiciones de exterior o interior en la prevalencia de T. canis y Ancylostoma spp. Los datos de prevalencia se compararon mediante la prueba ANOVA con un valor de significancia de 0,05. La Tabla 2 muestra que T. canis exhibió una frecuencia de distribución significativamente mayor en climas templados y secos en comparación con los estados caracterizados por climas cálidos, mientras que no hubo variación notable en la prevalencia de Ancylostoma spp. en regiones con predominantes climas cálidos, templados o secos. Asimismo, Ancylostoma spp. y T. canis se detectan con mayor frecuencia en verano. Se encontró que el 60,86% de los varones fueron positivos para anciolostomiasis y el 37,38% para toxocariasis. Además, T. canis se detectó con mayor frecuencia en cachorros menores de 6 meses de edad; mientras que Ancylostoma spp. fue más diagnosticado en perros adultos. Curiosamente, no se encontraron diferencias entre las razas de perros. El anquilostoma canino infectó al 65,54% de los perros al aire libre; sin embargo, T. canis se detectó igualmente en perros con un estado exterior o interior.
Figura 1: Recogida de muestras de heces de perros. (A) Se debe tener precaución al recolectar muestras de heces de perros salvajes. Cuando sea posible, las heces frescas deben recogerse y guardarse en una bolsa de plástico para su presentación y análisis coproparasitoscópico en el laboratorio. Las muestras deben refrigerarse a 4 °C y colocarse en cajas de espuma de poliestireno o sobres metálicos aislados dentro de las 24 h posteriores a la recolección. (B) Se recomiendan tres gramos de heces como estándar; Por lo tanto, 2-5 g es razonable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de una solución salina saturada y procesamiento de la suspensión fecal para microscopía. (A) La densidad ideal de una solución saturada hecha con sal debe ser superior a 1,20. Es muy recomendable comprobar que no haya cristales en el fondo y que la solución sea transparente. (B) Pasar la suspensión fecal a través de un colador de plástico elimina las partículas gruesas. (C) El circuito de inoculación debe exponerse a una llama (un quemador de laboratorio o un encendedor portátil común) para asegurarse de que esté libre de contaminación. (D) Deje que el asa de inoculación se enfríe y tome tres gotas de diferentes sitios en la superficie de la suspensión. (E) Después de colocar la primera gota en el portaobjetos de vidrio, evite mover el portaobjetos para reducir el derrame de la gota. El portaobjetos de vidrio proporciona una plataforma delgada y transparente que permite la observación de muestras. (F) Coloque la segunda gota en el centro del portaobjetos de vidrio. Tomar una segunda gota de la superficie de la suspensión fecal aumenta la probabilidad de encontrar huevos en una suspensión donde las estructuras parásitas pueden haber sido distribuidas de manera desigual. (G) Coloque la tercera gota en el portaobjetos de vidrio. Una tercera gota desde la superficie de la suspensión fecal permitirá observar otra zona donde se hayan concentrado los huevos flotantes. (H) Las tres gotas se observan por separado en el portaobjetos de vidrio para detectar huevos de nematodos de diferentes áreas de la superficie de la suspensión fecal. (I) Observar la muestra bajo un microscopio usando el objetivo 10x. Si el objetivo se cambia a 40x, coloque un cubreobjetos en las gotas de suspensión fecal. Cuando se observe un resultado positivo en la gota, asigne una cruz (+) para marcar la presencia de parásitos en el período de patente en sitios aleatorios de la superficie de suspensión fecal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Huevos de Toxocara canis y Ancylostoma spp. detectados por microscopía óptica con un aumento de 40x. (A) Huevos de Toxocara canis detectados por microscopía óptica con un aumento de 40x. El método de flotación permitió la visualización de campos microscópicos limpios libres de materiales gruesos (recolectados en un entorno de campo). Independientemente del método de preparación de la solución de flotación, los huevos fueron visibles y se observaron principalmente sin alteraciones morfológicas. (B) Huevos de Ancylostoma spp. detectados por microscopía óptica con un aumento de 40x. A pesar de que no se llevó a cabo ninguna concentración de heces (en un entorno de campo), el método de flotación simple abordó las deficiencias de la detección morfológica de huevos en las heces cuando el procedimiento se realizó de acuerdo con el método actual. (C) Huevos de T. canis y Ancylostoma spp. detectados por microscopía óptica con un aumento de 40x. Las características morfológicas de estos huevos (recuperados en un entorno de laboratorio) fueron claras a pesar de que no se realizó una concentración de muestras de heces y no difirieron de los huevos recuperados en un entorno de campo. Barras de escala = 75 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ancylostoma spp. | Toxocara canis | ||
| Clima | Clima cálido | 38.66A | 22.52A |
| Clima seco | 29.41A | 36.03A | |
| Clima templado | 31.93A | 41.44b | |
| Primavera | 23,76A | 19.81A | |
| Verano | 49.81b | 50.00b | |
| Otoño | 17.52A | 20.27A | |
| Invierno | 8.88C | 9,90C | |
| Género | Masculino | 60,86A | 62.61A |
| Hembra | 39.13ter | 37.38b | |
| Edad | 0-3 meses | 18.72A | 51.80A |
| 3-6 meses | 15.48A | 32.43b | |
| > 6 meses | 22.44A | 10.36C | |
| > 1 año | 43.33b | 5.40C | |
| Raza | Cruzas | 52.78A | 55,86A |
| Pura raza | 47.22A | 44.14bis | |
| Estado de la vivienda | Interior | 34.45A | 52.25A |
| Al aire libre | 65.54A | 47.74b |
Tabla 2: Prevalencia (%) de Ancylostoma spp. y Toxocara canis en perros en México durante 4 años según clima, temporada, sexo, edad, raza y estado de vivienda. Las indicaciones de los datos revelan que no hay una variación significativa en la prevalencia de Ancylostoma spp. en áreas caracterizadas por climas cálidos, templados o secos. En contraste, T. canis exhibe una prevalencia notablemente mayor en climas templados y secos en comparación con climas cálidos. Además, tanto Ancylostoma spp. como T. canis se identifican con mayor frecuencia durante la temporada de verano. El análisis de los datos demuestra además que el 60,86% de los perros machos dieron positivo en anciolostomiasis, mientras que el 37,38% dio positivo en toxocariasis. Además, T. canis se detecta con mayor frecuencia en cachorros de menos de 6 meses, mientras que Ancylostoma spp. es más frecuente en perros adultos. Curiosamente, no se observaron diferencias perceptibles entre las distintas razas de perros. Los resultados indican que el 65,54% de los perros que viven al aire libre están infectados con anquilostomas caninos, mientras que T. canis es igualmente frecuente entre los perros de interior y exterior. *Los valores medios dentro de una columna del factor (Clima, Estación, Sexo, Edad, Raza y Vivienda) seguidos de las mismas letras no son significativamente diferentes a P < 0.05 según la prueba ANOVA.
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Discussion
Los nematodos como T. canis y Ancylostoma spp. pueden habitar en el intestino delgado de los perros y tienen el potencial de transmitirse a los humanos. Los signos clínicos causados por T. canis son graves en perros jóvenes y se manifiestan como un crecimiento deficiente, problemas respiratorios o lesiones en el tracto digestivo28. En los perros adultos, la infección suele ser leve. El diagnóstico se basa en la identificación de huevos característicos en una muestra fecal. Esta condición es una causa frecuente para la prescripción de tratamiento antihelmíntico a perros29. Para entender la epidemiología de Toxocara, es fundamental reconocer que el parásito puede transferirse de la madre al cachorro tanto a través de la placenta antes del nacimiento como a través de la succión como una infección galactogénica poco después del parto. Los humanos pueden contraer T. canis al ingerir huevos infecciosos, lo que puede ocurrir a través de varios medios, como tierra contaminada o el pelaje de un perro infectado. En este caso, los humanos sirven como huéspedes paraténicos, y aunque no hay reproducción parasitaria, las larvas liberadas de los huevos pueden causar daño, particularmente en el caso de los niños30.
La infección por anquilostoma Ancylostoma spp. en perros ocurre cuando los animales ingieren las larvas o cuando las larvas penetran en la piel. Los cachorros pueden contraer la infección al consumir un huésped paraténico o a través de la vía lactogénica31. Los anquilostomas maduros se alimentan de sangre, lo que puede provocar anemia grave y síntomas gastrointestinales, especialmente en perros jóvenes. Las infecciones que se producen a través de la piel provocan dermatitis, que suele resolverse aproximadamente una semana después de la aparición de la infección. Se han empleado varios medicamentos antihelmínticos, acompañados de terapia de apoyo. Sin embargo, ha habido informes de resistencia a los antihelmínticos. El ancylostoma tiene el potencial de ser patógeno para los seres humanos. La transmisión transcutánea de larvas L3 puede conducir a una afección conocida como larva migrans cutánea. Estas lesiones generalmente se resuelven sin tratamiento en unos pocos meses. En raras ocasiones, los anquilostomas caninos pueden migrar al tracto gastrointestinal humano, induciendo enteritis eosinofílica30.
El diagnóstico preciso, económico y rápido de la parasitosis en perros es esencial para aumentar nuestro conocimiento epidemiológico de las helmintiasis caninas. Por esta razón, adaptamos un protocolo de la técnica de flotación simple para ser utilizado en un entorno de campo para detectar T. canis y Ancylostoma spp. Un tema relevante al que se enfrentó el protocolo actual fue la recolección de muestras de perros asilvestrados, ya que estos animales suelen ser difíciles de manipular. Por lo tanto, el muestreo se realizó observando y siguiendo a los perros hasta que defecaron, lo que hizo que el método de muestreo consumiera mucho tiempo, fuera desafiante y, de alguna manera, peligroso. De acuerdo con nuestra experiencia, recomendamos encarecidamente evaluar los estudios parasitológicos en perros de refugio.
En cuanto a la recuperación de huevos de helmintos zoonóticos, la coproscopia cualitativa continúa siendo la metodología comúnmente utilizada en el laboratorio de parasitología con fines diagnósticos1. Estudios anteriores han encontrado que la técnica de flotación que utiliza una solución salina saturada es más confiable que la microscopía directa. Por ejemplo, Dryden y colaboradores determinaron una sensibilidad del 95,15% para huevos de Ancylostoma spp. en 206 muestras fecales procesadas por la técnica de flotación y del 27,18% por microscopía directa32. Se acepta que la densidad de la solución de flotación es un factor crítico para el método de flotación 14,20,23. En soluciones que no alcanzan esa densidad, las formas parásitas tardan más en flotar o nunca flotan. Cuando una solución de flotación está sobresaturada, cristaliza en un par de minutos e incluso antes si se coloca un cubreobjetos20.
La elección de la solución de flotación en este protocolo se basó en la facilidad de preparación, la conveniencia, el costo y el impacto ambiental. Aunque la solución de azúcar tarda más en cristalizar, se debe agregar formalina o fenol como conservante y disminuir la sensación pegajosa o pegajosa; lo cual es un inconveniente en las condiciones de campo que prevalecieron en este estudio. Además, la eliminación de reactivos químicos es un tema complejo debido a las regulaciones ambientales. Los datos de este estudio demostraron que la solución saturada preparada con sal de mesa común en condiciones de campo mediante el uso de una botella de refresco debido a la falta de disponibilidad de equipos de laboratorio para preparar y hervir una solución de flotación, fue tan efectiva como la preparada en un entorno de laboratorio. La única diferencia perceptible es el mayor tiempo que se tarda en agitar la botella de refresco hasta que se puede ver una solución transparente. Las observaciones microscópicas fueron igualmente limpias para la muestra preparada utilizando ambos métodos para preparar la solución saturada. Es importante realizar más estudios en el futuro con un mayor número de muestras para confirmar la afirmación antes mencionada. Sin embargo, lleva mucho tiempo y requiere el esfuerzo físico de agitar la solución dentro de la botella durante horas. Otro paso crítico del protocolo consiste en dejar reposar la suspensión fecal durante al menos 15 minutos para permitir que los huevos floten y se concentren en la superficie. Sin embargo, cuanto mayor sea el tiempo de reposo, más desechos flotarán y, después de unas horas, los huevos se deformarán o romperán. Teniendo en cuenta que la sensibilidad y la especificidad de los métodos coproparasitoscópicos son bajas y que la precisión de estos métodos como pruebas diagnósticas depende de las habilidades del usuario, en el presente estudio, parasitólogos capacitados y experimentados realizaron la técnica de flotación e identificaron los parásitos.
Este estudio, hasta donde sabemos, es el primero en estimar la prevalencia de Ancylostoma spp. y T. canis en perros en México utilizando muestras fecales examinadas con el método de flotación simple en un entorno de campo. Se demostró que la técnica de flotación que utilizamos, a pesar de las décadas que lleva en uso, sigue siendo una prueba diagnóstica altamente efectiva, económica y rápida14. Aun así, existen técnicas coproparasitoscopias con mayor sensibilidad y especificidad que la que utilizamos para el diagnóstico de helmintos caninos; como la concentración de sedimentación, como es el caso de la técnica de Fausto. Además, es importante tener en cuenta que Fausto, que es un método de concentración, también ha demostrado ser más eficaz en la detección de protozoos como Giardia33. Sin embargo, el método coproparasitoscópico que elegimos para este estudio tuvo varias ventajas, como el costo. La técnica de Fausto es más costosa que la flotación con solución salina saturada porque requiere equipos adicionales y costosos, como una centrífuga. Otros métodos de concentración, como los que utilizan reactivos como el sulfato de zinc, son más caros que la sal común y necesitan más tiempo debido al número de lavados necesarios en la centrífuga. Por lo tanto, la técnica de Fausto está limitada para su uso en el trabajo de campo donde no es común el acceso a una centrífuga.
Lo más importante es que una limitación de la técnica de flotación simple es que no es lo suficientemente sensible como para detectar ooquistes de Cryptosporidium , quistes de Giardia o huevos de Trichuris . Por lo tanto, deben utilizarse técnicas que utilicen procedimientos de centrifugación para concentrar las formas de parásitos si se pretende el diagnóstico de estas especies. Es importante destacar que las tasas de positividad de los géneros reportados en este estudio no deben considerarse concluyentes, ya que se utilizó un método de conveniencia como estrategia de muestreo. Es importante tener en cuenta que puede haber situaciones, como en refugios con un manejo de animales desafiante, en las que se vuelve crucial identificar los parásitos helmintos en los perros. Como resultado, es posible que este protocolo necesite ajustes en el futuro para adaptarse a la recolección de muestras combinadas.
Como punto débil, debe tenerse en cuenta que el método de flotación simple y la preparación de la solución saturada de NaCl se desarrollaron para un propósito específico: examinar las heces de los perros en condiciones de campo en su mayoría, pero la sensibilidad del procedimiento de flotación simple generalmente se ha considerado baja. Por lo tanto, para detectar quistes o huevos de especies de parásitos más pesadas, se recomienda encarecidamente el uso de una técnica de concentración. Dada la baja sensibilidad del método de flotación simple, independientemente de si se realiza en un entorno de campo o de laboratorio, era razonable dudar de que esta técnica fuera útil como método de elección para estudios epidemiológicos de parásitos helmintos caninos. No obstante, la alta prevalencia de Ancylostoma spp. en perros en este estudio y la detección de huevos de T. canis indican que el método de flotación simple, ya sea realizado en un entorno de campo o de laboratorio, es útil para proporcionar evidencia que pueda apoyar futuros estudios epidemiológicos y proponer medidas de control y prevención para reducir la infección de perros y humanos con estos nematodos.
Utilizando el método de flotación simple, se analizaron los factores que afectan la recuperación de huevos de T. canis y Ancylostoma spp. a partir de heces caninas. Los hallazgos de T. canis estuvieron de acuerdo con las últimas investigaciones que indican que los parásitos son notablemente más prevalentes en las regiones templadas y tropicales. Esto se alinea con estudios previos que han investigado cómo los factores ambientales, particularmente la temperatura y las precipitaciones, influyen en el rango ecológico de las especies de parásitos 34,35,36. Los presentes resultados mostraron que ambos helmintos infectan a los machos en una proporción significativamente mayor. Es razonable especular que este hallazgo se debió a que los varones son inmunológicamente menos reactivos a las infecciones37,38. La edad influye en la prevalencia de T. canis, ya que los cachorros fueron los más afectados por este parásito. Este hallazgo se alinea con investigaciones anteriores que indican que este parásito tiende a afectar a los cachorros en mayor medida, mientras que los adultos desarrollan una mayor resistencia, lo que resulta en una menor probabilidad de infección 6,39. Tanto los perros mestizos como los de raza pura mostraron prevalencias comparables de Toxocara canis y Ancylostoma spp. Sin embargo, los perros asilvestrados exhibieron una mayor prevalencia de Ancylostoma spp. en comparación con los perros que residen en entornos domésticos. Este hallazgo está en desacuerdo con informes previos que no detectaron diferencias entre las razas de perros6. Se puede concluir que las aplicaciones futuras de la preparación de la solución salina saturada y el método de flotación simple utilizado en este protocolo pueden realizarse para exámenes fecales de rutina en condiciones de campo o de laboratorio.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la Universidad Nacional Autónoma de México por proporcionar los recursos financieros a través de la subvención PAPIIT IN218720 y a la Dra. Claudia Mendoza por otorgar la prórroga solicitada. Esta obra está dedicada a mi querida Nicole, que falleció en 2019. Siempre vivirás en mi corazón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
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