Summary
Diese Arbeit beschreibt die Verwendung einer Flotationsmethode zur Identifizierung von Toxocara canis und Ancylostoma spp., die in Kotproben von Hunden in Mexiko von 2017 bis 2021 unter Feldbedingungen nachgewiesen wurden.
Abstract
Die Diagnose von Hundeparasiten mit zoonotischem Potenzial wie Toxocara canis und Ancylostoma caninum unter Feldbedingungen ist in der Regel schwierig, da der Zugang zu einem Labor in ländlichen und vorstädtischen Gebieten Mexikos begrenzt ist. Ziel dieser Studie war es, T. canis und Ancylostoma spp. in Kotproben von Hunden nachzuweisen, die von 2017 bis 2021 in Mexiko unter Feldbedingungen gesammelt wurden. Die Berechnung der Stichprobengröße ergab eine Zieleinschreibung von 534 Hunden im ganzen Land.
Die Proben wurden nach dem Stuhlgang direkt aus dem Rektum oder dem Boden entnommen. Die Proben wurden in einzelnen, dicht verschlossenen Plastikbeuteln bei 4 °C gelagert. Eine gesättigte Natriumchloridlösung (spezifisches Gewicht [SpG] 1,20) wurde sowohl unter Feld- als auch unter Laborbedingungen hergestellt. Innerhalb von 3 Tagen nach der Entnahme wurden 2-4 g Kot mit einer Flotationsmethode auf Parasiten getestet, indem jede Kotprobe in einer Kochsalzlösung suspendiert wurde. Der Kot wurde mit der Flotationslösung vermischt und mit einem Metalllöffel zerkleinert.
Sobald eine gleichmäßige Konsistenz erreicht war, wurde die Kotprobe mit einem Sieb in einen neuen Plastikbecher gegossen und 10-15 Minuten ruhen gelassen. Drei Tropfen von der Oberseite der Mischung wurden mit einer sterilisierten Impföse aufgefangen. Die Objektträger wurden auf das Mikroskop gelegt und die Parasiten wurden von ausgebildeten Parasitologen identifiziert. Kotproben von 1.055 Hunden wurden mikroskopisch untersucht. Die Anzahl der positiven Proben für Ancylostoma spp. betrug 833 (78,95 % Häufigkeit) und 222 (21,04 %) für T. canis. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig es ist, zoonotische Helminthen bei Hunden zu identifizieren, die in städtischen und ländlichen Gebieten in Mexiko leben, und zwar mit einer koproparasitoskopischen Technik im Labor und unter Feldbedingungen.
Introduction
Magen-Darm-Parasiten sind eines der häufigsten Gesundheitsprobleme, die Hunde betreffen1. Schätzungen gehen davon aus, dass es weltweit ~700 Millionen Haushunde gibt, und etwa 175 Millionen können als freilaufend eingestuft werden2. Mehr als 60 Parasitenarten werden zwischen Hunden und Menschen geteilt, was darauf hindeutet, dass Hunde eine Infektionsquelle für Menschen mit diesen Parasiten sein könnten3. Toxocara canis und Ancylostoma caninum sind zwei parasitäre Arten, die Hunde und versehentlich auch menschliche Wirte infizieren. Derzeit gibt es mehrere Studien über die Orte, an denen diese Helminthen in Mexiko überleben und sich vermehren können. Die Prävalenz von Toxocara bei Hunden variiert zwischen 0 % und über 87 % in den Vereinigten Staaten, Mexiko, Mittelamerika und der Karibik4. Toxocara canis und Ancylostoma spp. sowie andere parasitäre Arten bei Hunden wurden zuvor in Mexiko berichtet 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabelle 1).
| Parasitäre Arten | Region | Prävalenz (%) | Referenz |
| Ancylostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Kokzidien-Oozysten | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocephalides | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Bandwürmer | Baja California | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabelle 1: Regionale Prävalenz (%) von Hundeparasiten in Mexiko von 2001 bis 2020. Die Ergebnisse früherer Untersuchungen, die von 2001 bis 2020 durchgeführt wurden, haben die Identifizierung der Verbreitung von Hundeparasiten in verschiedenen städtischen und ländlichen Gebieten Mexikos ermöglicht. Diese Studien bieten ein tiefes Verständnis der epidemiologischen Elemente, die für die Persistenz von Hundeparasiten in verschiedenen Ökosystemen förderlich sind, und tragen zu einer umfassenden Bewertung der zoonotischen Auswirkungen einiger Parasitenarten bei.
Lebenszyklusstadien von Darmparasiten wie Eiern, Zysten, Oozysten oder Larven können in Stuhlproben gefunden werden. So liefert die Untersuchung von Fäkalien wertvolle Informationen über die Parasiten eines Tieres. Die Notwendigkeit einer Methode zum Nachweis von Ancylostomidae-Eiern im menschlichen Kot führte 1878 zur Verwendung des einfachen Kotabstrichs, der viele Jahre lang zum Nachweis von Magen-Darm-Parasiten verwendet wurde, aber als nicht sehr empfindlich galt. Daher entstand die Notwendigkeit, bessere kopromikroskopische Methoden zu entwickeln14. Mehr als 100 Jahre sind vergangen, seit die Flotationstechnik zur Gewinnung und Zählung von Parasiteneiern in Kotproben erstmals beschrieben wurde15. Seitdem gelten mehrere Methoden und Varianten der Flotationstechnik als Standard für den Nachweis einiger Parasiten in ihren Wirten.
Zum Beispiel beschrieb Lane 1924 ein Verfahren mit der direkten Zentrifugalflotationstechnik, bei der das Sediment zentrifugiert und anschließend in einer gesättigten Natriumchloridlösung mit SpG 1,2 in 1 g (Lane) oder 10 g (Stoll-Modifikation) aufgewirbelt wird. Die Flotationstechnik wurde anschließend durch die Verwendung von Lösungen mit unterschiedlichem SpG14 modifiziert. Im Jahr 1939 berichteten Gordon und Whitlock über die Nachteile von Stolls Technik aufgrund von Störungen durch Detritus bei der Visualisierung von Parasiteneiern und entwickelten die quantitative Methode, die als McMaster16 bekannt ist. Im Jahr 1979 zeigten O'Grady und Slocombe, dass das spezifische Gewicht der Lösung, der Zeitpunkt und die Maschenweiten der Siebe die Genauigkeit der Eiererkennung mit der Flotationstechnikbeeinflussen 17. Da in den letzten Jahrzehnten mehrere Modifikationen an der Flotationstechnik vorgenommen wurden, besteht ein dringender Bedarf an einer Standardisierung der Flotationsmethoden. Derzeit ist der Nachweis von Helmintheninfektionen bei Hunden im Rahmen der Prävention von zoonotischen Parasiten erforderlich, um geeignete Anthelminthika-Behandlungen anzuwenden, um die Umweltkontamination mit infektiösen Stadien zoonotischer Nematoden zu begrenzen18.
Unter den qualitativen Methoden ist die Kotflotationstechnik weit verbreitet und akzeptiert, da sie nicht viel Ausrüstung erfordert, einfach, kostengünstig und reproduzierbar ist. Es hat jedoch einen großen Nachteil, da es ihm an Empfindlichkeit mangelt, wenn die Intensität der Infektion niedrigist 19. Die Fähigkeit, das Vorhandensein einer größeren Anzahl parasitärer Elemente wie Eier, Oozysten, Zysten oder Nematodenlarven aufzudecken, wird normalerweise durch die Dichte der Lösungbestimmt 20.
Frühere Berichte haben koproparasitologische Techniken zum Nachweis von Nematodeneiern bei Hunden verglichen. Im Hinblick auf den Nachweis von beweglichen Protozoen werden direkte Stuhlabstriche verwendet; während Sedimentationsmethoden nützlich sind, um schwere Eier von Parasiten wie Trematoden zu diagnostizieren21. Einer der am weitesten verbreiteten feldbasierten diagnostischen Tests ist die Stuhlabstrichmethode. Die geringe Empfindlichkeit dieser Technik kann jedoch auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass sie Schmutz enthält, der die Erkennung von Parasiteneiern stört. Durch die Integration eines Siebschritts zusammen mit Lösungen, die den richtigen SpG liefern, bietet die Flotationsmethode eine klarere und weniger überladene Beobachtung von Ascarid- und Hakenwurmeiern. Dies führt zu einem präziseren und effizienteren Verfahren für das mikroskopische Screening22. Ebenso werden einfache Flotations- und direkte Zentrifugalflotationstechniken sehr häufig verwendet, um Parasiteneier und Oozysten zu gewinnen14. Die klassischen Flotationsmethoden können je nach Verwendung einer Zählkammer als qualitativ oder quantitativ angesehen werden, wie z. B. die McMaster-Methode15. Da die Flotationstechnik jedoch eine geringe Empfindlichkeit aufweist und sich auf den Nachweis von Parasiten während der Patentlaufzeit konzentriert, sollten negative Ergebnisse nicht als schlüssig angesehen werden. Die Genauigkeit hängt jedoch nicht nur vom Konservierungsverfahren von Kotproben oder der SpG von Flotationslösungen ab, sondern auch von der technischen Kompetenz und Erfahrung in der Durchführung von Kotuntersuchungen des Anwenders.
Daher wurden andere Methoden zum Nachweis von Hundeparasiten im Kot erforscht. Es ist allgemein anerkannt, dass einer der am weitesten verbreiteten Ansätze für die Diagnose von intestinalen Helmintheninfektionen bei Hunden die FLOTAC-Technik ist, eine multivalente, empfindliche und genaue Methode, die im Vergleich zu einem Flotationsprotokoll in einem Röhrchen und der McMaster-Technik genaue und zuverlässige Ergebnisse für die Diagnose von A. caninum bei Hunden liefert19. 23. Urheberrecht Sedimentationsmethoden sind nützlich für die Rückgewinnung von Egeleiern, embryonierten Nematodeneiern und den meisten Bandwurmeiern, die nicht an der Oberfläche einer Flotationslösung gewonnen werden können, da diese Strukturen nicht schwimmen24. Eine Methode, die sich als überlegen gegenüber Flotations-/Sedimentationstechniken erwiesen hat, ist die modifizierte Doppelzentrifugalflotationsmethode, da sie den Nachweis von Cestode-Eiern im Kot ermöglicht, weniger zeitaufwändig ist, Anoplocephala-Eier von Fäkalien trennt und die Kristallisation verringert25. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich zum Nachweis von Askarideneiern mit hoher Empfindlichkeit eingesetzt26. Einige dieser oben genannten Techniken und Zentrifugalmethoden wie der Ovassay erfordern jedoch im Gegensatz zu dem in dieser Studie vorgeschlagenen Flotationsprotokoll die Probenkonservierung in Reagenzien wie Formalin, kommerziellen Kits, Probenverarbeitung unter Laborbedingungen und die Verwendung von Reagenzien wie Zinksulfat27, die teuer sind und spezielle Entsorgungsverfahren erfordern, um Umwelttoxizität zu vermeiden.
Die Verwendung von Techniken, die die Empfindlichkeit der Flotationsmethode durch Zugabe von Lösungen mit hohem SpG erhöhen, wurde in letzter Zeit bevorzugt. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Nachteil dieser Lösungen die Zunahme von Schmutz in der Endzubereitung und damit die ungenaue Erkennung von Parasiteneiern ist. Darüber hinaus beeinflussen die kommerzielle Verfügbarkeit von Materialien, Reagenzien, Kosten, Umweltverträglichkeitsfragen und die Schwierigkeit der Anwendung von Zentrifugalmethoden die Auswahl einer Flotationstechnik14, die unter Feldbedingungen im Gegensatz zu dem Protokoll, das wir in dieser Arbeit vorstellen, eine Herausforderung darstellen kann. Die Herstellung der Flotationslösungen mit Speisesalz ist gegenüber der Verwertung von Zucker vorteilhaft, da Zucker unter Feldbedingungen Insekten wie Wespen und Bienen anlockt und Präparate klebrig werden. Darüber hinaus sind Lösungen wie Phenol, das Zuckerlösungen zugesetzt wird, um Klebrigkeit zu vermeiden, oder ZnSO4gemäß den Umweltschutzrichtlinien komplex zu entsorgen und können nicht vor Ort entsorgt werden. im Gegensatz zu einer Kochsalzlösung.
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zum Nachweis von T . canis - und Ancylostoma spp.-Eiern in Stuhlproben unter Verwendung einer Anpassung der einfachen Flotationstechnik unter Feld- und Laborbedingungen zu demonstrieren. Nach dem hier beschriebenen Protokoll und unter Verwendung eines Mikroskops mit einer Pufferbatterie ist die Diagnose dieser tierischen Parasiten in ländlichen und vorstädtischen Gebieten möglich, wenn keine Laborgeräte und -infrastruktur verfügbar sind. Die in dieser Arbeit beschriebene einfache Flotationsmethode kann schnelle Ergebnisse liefern und ist eine nicht-invasive und kostengünstige Technik für das Routine-Screening.
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Protocol
Der Einsatz und die Pflege von Hunden wurde von der Nationalen und Autonomen Universität von Mexiko genehmigt.
1. Entnahme von Kotproben
HINWEIS: Behandeln Sie den Hund mit Hilfe eines Tierarztes oder des Besitzers des Tieres.
- Bei verwilderten Hunden (Abbildung 1A) oder nervösen Tieren sollten Sie direkt nach dem Stuhlgang oder spätestens 10 Minuten später Proben vom Boden sammeln.
- Schmieren Sie OP-Handschuhe oder dünnwandige Polyethylenbeutel mit Wasser oder Vaseline. Um Kotproben aus dem Rektum zu entnehmen, tragen Sie OP-Handschuhe oder dünnwandige Polyethylenbeutel.
- Sammeln Sie mindestens 2 g Kot von jedem Hund (Abbildung 1B).
- Identifizieren Sie einzelne Kotproben wie folgt: Datum, Ort (GPS-Koordinaten des Global Positioning System [GPS] mit Google Maps), Zuweisung einer Identifikationsnummer für jedes Tier, ungefähres Alter des Hundes, Geschlecht des Hundes, Rasse, Haus- oder Außenhund (Wildhund).
- Verschließen Sie die Beutel mit der Kotprobe mit einem festen Knoten. Bewahren Sie die Beutel gekühlt auf (4-8 °C), wenn Stuhlproben nicht innerhalb von 3-4 Stunden nach der Entnahme analysiert werden.
2. Herstellung einer gesättigten Salzlösung für die Felddiagnose
Anmerkungen: Wenn der Zugang zu einer Waage, Messmaterial, Herden oder Gas zum Kochen von Wasser nicht vorhanden oder eingeschränkt ist, kann die gesättigte Kochsalzlösung einfach mit Wasser, gewöhnlichem Speisesalz, einem 12 oz (355 ml) Plastikbecher und einer leeren 1-Liter-Soda-Plastikflasche hergestellt werden.
- Waschen Sie eine leere 1-Liter-Limonadenflasche gründlich. Füllen Sie die Flasche mit 1 l Wasser.
- Füllen Sie einen 12-Unzen-Plastikbecher mit gewöhnlichem Speisesalz.
- Gib das Salz in die Limonadenflasche.
- Verschließen Sie die Limonadenflasche fest mit dem Schraubverschluss. Schütteln Sie die Lösung kräftig, bis sich das Salz nicht mehr auflöst.
HINWEIS: Das Schütteln der Lösung in der Sodaflasche bis zur vollständigen Auflösung des Salzes kann bis zu 90 Minuten dauern.
3. Herstellung einer gesättigten Salzlösung für die Labordiagnostik
- Wiegen Sie 420 g Kochsalz.
- 420 g Salz in 1 l Wasser auflösen.
- Kochen Sie die Lösung, bis sich kein Salz mehr auflöst.
- Filtern Sie die Lösung, um das ungelöste Salz zu entsorgen.
- Überprüfen Sie die Konzentration der Lösung mit einem Hydrometer oder Densitometer für schwere Flüssigkeiten.
HINWEIS: Die ideale Konzentration hat einen SpG von 1,20, um bessere Ergebnisse zu erzielen (Abbildung 2A). Die Schwimmfähigkeit eines Eies wird durch seine Wechselwirkung mit der Lösung beeinflusst, was zu der unterschiedlichen Fähigkeit von Eiern beiträgt, in Lösungen mit dem gleichen spezifischen Gewicht zu schwimmen. Um eine optimale Eirückgewinnung zu erreichen, ist es daher wichtig, den oberen Bereich des spezifischen Gewichts in der Flotationslösung zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass er den der Zielparasitenelemente6 übersteigt.
4. Flotationsmethode
HINWEIS: Wenn Kotproben zu trocken oder hart sind, mazerieren Sie sie in einem Mörser.
- Geben Sie mit einem Löffel ca. 3 g Kot in einen Plastikbecher (~8,5 cm Höhe und ~5,5 cm Durchmesser).
- Fügen Sie 1 ml der gesättigten Salzlösung hinzu, bis eine Paste erhalten wird.
- 1 Minute umrühren und 100 ml gesättigte Salzlösung hinzufügen.
- Geben Sie diese Suspension durch ein Kunststoffsieb in einen zweiten Plastikbecher, um grobe Partikel zu vermeiden (Abbildung 2B).
- Lassen Sie die Aufhängung 15-20 Minuten stehen.
- Legen Sie eine Impfschlaufe 1 s lang in eine Flamme, um sicherzustellen, dass sie frei von Eiern, Zysten oder Oozysten ist (Abbildung 2C).
- Warten Sie 5 s, bis die Impfschlaufe abgekühlt ist (Abbildung 2D).
- Nehmen Sie drei Tropfen von der Oberfläche der Suspension mit der Impfschlaufe. Legen Sie jeden der drei Tropfen separat auf einen Objektträger (Abbildung 2E-G)
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tropfen nicht miteinander in Berührung kommen (Abbildung 2H). - Beobachten Sie unter dem Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv (Abbildung 2I). Legen Sie ein Deckglas an, wenn die Vergrößerung auf 40x erhöht wird.
- Wenn ein positives Ergebnis im Tröpfchen beobachtet wird, weisen Sie dem Laborlogbuch ein Kreuz (+) zu, um das Vorhandensein von Parasiten während der Patentperiode an zufälligen Stellen der Stuhlsuspensionsoberfläche aufzuzeichnen.
5. Auslegung der Flotationsmethode
HINWEIS: Negative Ergebnisse sind nicht schlüssig.
- Führen Sie eine Reihe von drei Tests mit Proben von 3 aufeinanderfolgenden Tagen durch, um die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen.
HINWEIS: Positive Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein von Parasiten während der Patentlaufzeit hin.
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Representative Results
In dieser Arbeit werden Sammel- und koproparasitoskopische Verfahren zur Identifizierung von T. canis und Ancylostoma spp. beschrieben. Der Grund für die Anpassung der einfachen Kotflotationsmethode zum Nachweis von Helmintheneiern bei Hunden ist, dass diese Technik kostengünstig ist, da die Lösungen, Geräte und Materialien kostengünstig sind. Daher hat die Methode eine hohe Probenhandhabungskapazität, da mehrere Proben in kurzer Zeit verarbeitet werden können. Darüber hinaus ist die einfache Kotflotationsmethode einfach durchzuführen und relativ empfindlich.
Die Stichprobengröße und die Auswahl der Tiere wurden nach Bequemlichkeit getroffen, die hauptsächlich durch die Bereitschaft des Besitzers der Tiere und die Sicherheit der sich nähernden wilden Hunde bestimmt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde die Flotationsmethode verwendet, um das Vorkommen und die Häufigkeit von Ancylostoma spp. und T. canis bei Hunden Canis lupus familiaris in Mexiko während 4 Jahren ab 2017 zu bewerten. Kotproben von 1.638 Hunden wurden gesammelt und mikroskopisch untersucht. Insgesamt waren 1.235 Hunde positiv auf T. canis und Ancylostoma spp. Eines der Ziele der Anwendung der Flotationsmethode war es, ihre Wirksamkeit bei der Beurteilung des Auftretens von Toxocara oder Ancylostom zu demonstrieren, aber wir wollten auch eine tiefere Untersuchung der Faktoren durchführen, die ihre Prävalenz beeinflussen könnten. Infolgedessen wurden 185 Tiere mit Mischinfektionen verworfen. Die Anzahl der positiven Proben für Ancylostoma spp. betrug 833 (78,95 % Häufigkeit) und 222 (21,04 %) für T. canis. Von den 1.050 Proben wurden 75,5 % (793 Proben) in einer Feldumgebung verarbeitet und abgelesen, indem die Flotationslösung mit einer Sodaflasche hergestellt und ein Mikroskop mit 3 x 1,2 V AA-Akkus für 4 Stunden Dauerbetrieb verwendet wurde. Die restlichen 257 Kotproben wurden im Labor untersucht.
Ein Ziel dieser Studie war es, eine Flotationslösung und eine Methode im Feld zu verwenden, um die Diagnose von zwei Wurmparasiten von Hunden in Gebieten zu beschleunigen und zu erleichtern, in denen keine Laborinfrastruktur oder -ausrüstung verfügbar ist. Die Feldanwendung der Flotationsmethode ermöglichte es uns, die Ergebnisse sofort nach jeder mikroskopischen Messung an 400 Besitzer zu kommunizieren, um Empfehlungen für Anthelminthika-Behandlungen und vorbeugende Maßnahmen zu geben und so die Ausbreitung von Parasiten bei Menschen oder Haustieren zu vermeiden. Ebenso ermöglichte die Flotationstechnik im Freiland, verwilderte Hunde zu untersuchen und ihnen eine anthelmintische Behandlung mit Leckerlis oder Futter zukommen zu lassen. Abbildung 3A und Abbildung 3B zeigen Eier von T. canis bzw. Ancylostoma spp., die beobachtet wurden, nachdem die Flotationslösung und -technik in einer Feldumgebung durchgeführt wurden. Wenn frische Stuhlproben der Flotationsmethode in einer Feldumgebung unterzogen wurden, war die in einer Sodaflasche hergestellte Lösung in der Lage, Helmintheneier in die Flotation zu bringen. Die Produktion von Salzkristallen und Luftblasen wurde mit den in einer Laborumgebung abgelesenen Proben verglichen, und der Bediener konnte keinen Unterschied feststellen. Diese Beobachtung ist ermutigend und stellt das Wissen in Frage, dass die Konzentration von Kotproben eine genauere mikroskopische Messung garantiert.
Bei der Verarbeitung der Flotationslösung und der Stuhlproben in einer Laborumgebung wurde kein Unterschied in Bezug auf die Morphologie und Klarheit der Messwerte unter dem Mikroskop wahrgenommen, da die gleiche Menge an Trümmern gleichzeitig sowohl beim kopromikroskopischen Feld- als auch beim Labornachweis von Parasiten schwamm. Abbildung 3A, B zeigen T . canis - bzw. Ancylostoma spp.-Eier, die aus den 257 Proben gewonnen wurden, die nach dem Transport von Proben aus städtischen, vorstädtischen und ländlichen Gebieten in einer voll ausgestatteten Laborumgebung verarbeitet wurden. Diese Parasiteneier unterschieden sich morphologisch nicht von denen, die unter Feldbedingungen beobachtet wurden (Abbildung 3C).
Dieses Protokoll lieferte eine ausreichende Anzahl von Ergebnissen, um den Einfluss von Standort, Jahreszeit, Geschlecht, Rasse, Alter und Außen- oder Innenbedingungen auf die Prävalenz von T. canis und Ancylostoma spp. zu bewerten. Die Prävalenzdaten wurden mit dem ANOVA-Test mit einem Signifikanzwert von 0,05 verglichen. Tabelle 2 zeigt, dass T. canis eine signifikant höhere Verbreitungshäufigkeit in gemäßigten und trockenen Klimazonen aufwies als in Staaten, die durch warmes Klima gekennzeichnet waren, während es keine nennenswerten Unterschiede in der Prävalenz von Ancylostoma spp. in Regionen mit vorherrschend warmem, gemäßigtem oder trockenem Klima gab. Ebenso werden Ancylostoma spp. und T. canis am häufigsten im Sommer nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass 60,86 % der Männer positiv für Ancylostomiasis und 37,38 % für Toxocariasis waren. Darüber hinaus wurde T. canis häufiger bei Welpen unter 6 Monaten nachgewiesen; während Ancylostoma spp. eher bei erwachsenen Hunden diagnostiziert wurde. Interessanterweise wurde kein Unterschied zwischen den Hunderassen festgestellt. Der Hundehakenwurm infizierte 65,54 % der Hunde im Freien; T. canis wurde jedoch gleichermaßen bei Hunden mit einem Outdoor- oder Indoor-Status nachgewiesen.
Abbildung 1: Stuhlprobenentnahme von Hunden. (A) Bei der Entnahme von Stuhlproben von verwilderten Hunden ist Vorsicht geboten. Wenn möglich, müssen frische Fäkalien gesammelt und in einer Plastiktüte aufbewahrt werden, um sie im Labor einzureichen und zu koproparasitoskopisch zu analysieren. Die Proben müssen bei 4 °C gekühlt und innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme in Styroporboxen oder isolierte Metallumschläge gelegt werden. (B) Drei Gramm Kot werden als Standard empfohlen; daher sind 2-5 g angemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Herstellung einer gesättigten Salzlösung und Verarbeitung der Stuhlsuspension für die Mikroskopie. (A) Die ideale Dichte einer mit Salz hergestellten gesättigten Lösung sollte über 1,20 liegen. Es wird dringend empfohlen zu überprüfen, ob sich am Boden keine Kristalle befinden und die Lösung transparent ist. (B) Durch das Passieren der Fäkaliensuspension durch ein Kunststoffsieb werden grobe Partikel entfernt. (C) Die Impföse muss einer Flamme (einem Laborbrenner oder einem gewöhnlichen tragbaren Feuerzeug) ausgesetzt werden, um sicherzustellen, dass sie frei von Verunreinigungen ist. (D) Lassen Sie die Impföse abkühlen und nehmen Sie drei Tropfen von verschiedenen Stellen auf der Oberfläche der Suspension. (E) Vermeiden Sie nach dem Aufsetzen des ersten Tropfens auf den Objektträger das Verschieben des Objektträgers, um das Verschütten des Tropfens zu verringern. Der Glasobjektträger bietet eine dünne und transparente Plattform, die die Beobachtung von Proben ermöglicht. (F) Legen Sie das zweite Tröpfchen in die Mitte des Objektträgers. Die Entnahme eines zweiten Tropfens von der Oberfläche der Stuhlsuspension erhöht die Wahrscheinlichkeit, Eier in einer Suspension zu finden, in der parasitäre Strukturen möglicherweise ungleichmäßig verteilt sind. (G) Legen Sie das dritte Tröpfchen auf den Objektträger. Ein dritter Tropfen von der Oberfläche der Stuhlsuspension ermöglicht die Beobachtung eines anderen Bereichs, in dem sich schwimmende Eier konzentriert haben könnten. (H) Die drei Tropfen werden separat auf dem Objektträger beobachtet, um Nematodeneier aus verschiedenen Bereichen der Oberfläche der Stuhlsuspension nachzuweisen. (I) Beobachten Sie die Probe unter einem Mikroskop mit dem 10x-Objektiv. Wenn das Objektiv auf 40x geändert wird, legen Sie ein Deckglas auf die Tröpfchen der Fäkaliensuspension. Wenn ein positives Ergebnis im Tröpfchen beobachtet wird, weisen Sie ein Kreuz (+) zu, um das Vorhandensein von Parasiten in der Patentperiode an zufälligen Stellen der Stuhlsuspensionsoberfläche zu markieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Eier von Toxocara canis und Ancylostoma spp., die lichtmikroskopisch mit 40-facher Vergrößerung nachgewiesen wurden. (A) Eier von Toxocara canis , die durch Lichtmikroskopie mit 40-facher Vergrößerung nachgewiesen wurden. Die Flotationsmethode ermöglichte die Visualisierung sauberer mikroskopischer Felder, die frei von groben Materialien (gesammelt in einer Feldumgebung) sind. Unabhängig von der Art der Herstellung der Flotationslösung waren Eier sichtbar und wurden hauptsächlich ohne morphologische Veränderungen beobachtet. (B) Eier von Ancylostoma spp., die lichtmikroskopisch mit 40-facher Vergrößerung nachgewiesen wurden. Obwohl keine Kotkonzentration (im Freiland) durchgeführt wurde, wurden mit der einfachen Flotationsmethode die Mängel beim morphologischen Nachweis von Eiern im Kot behoben, wenn das Verfahren nach der vorliegenden Methode durchgeführt wurde. (C) Eier von T. canis und Ancylostoma spp., die lichtmikroskopisch mit 40-facher Vergrößerung nachgewiesen wurden. Die morphologischen Merkmale dieser Eier (die in einer Laborumgebung gewonnen wurden) waren eindeutig, obwohl keine Konzentration von Stuhlproben durchgeführt wurde, und unterschieden sich nicht von den Eiern, die im Freiland gewonnen wurden. Maßstabsleisten = 75 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Ancylostoma spp. | Toxocara canis | ||
| Klima | Warmes Klima | 38,66A | 22,52A |
| Trockenes Klima | 29,41A | 36,03A | |
| Gemäßigtes Klima | 31,93A | 41,44Mrd. | |
| Feder | 23,76A | 19,81a | |
| Sommer | 49,81Mrd. | 50,00Mrd. | |
| Herbst | 17,52A | 20,27A | |
| Winter | 8,88c | 9,90c | |
| Geschlecht | Männlich | 60,86A | 62,61A |
| Weiblich | 39,13Mrd. | 37,38Mrd. | |
| Alter | 0-3 Monate | 18,72A | 51,80A |
| 3-6 Monate | 15,48Uhr | 32,43Mrd. | |
| > 6 Monate | 22,44A | 10.36c | |
| > 1 Jahr | 43,33Mrd. | 5,40C | |
| Rasse | Kreuzung | 52,78A | 55,86A |
| Reinrassig | 47,22A | 44,14a | |
| Wohnstatus | Innen | 34,45A | 52,25A |
| Im Freien | 65,54A | 47,74Mrd. |
Tabelle 2: Prävalenz (%) von Ancylostoma spp. und Toxocara canis bei Hunden in Mexiko während 4 Jahren nach Klima, Jahreszeit, Geschlecht, Alter, Rasse und Haltungsstatus. Die Daten zeigen, dass es keine signifikanten Unterschiede in der Prävalenz von Ancylostoma spp. in Gebieten gibt, die durch warmes, gemäßigtes oder trockenes Klima gekennzeichnet sind. Im Gegensatz dazu weist T. canis in gemäßigten und trockenen Klimazonen eine deutlich höhere Prävalenz auf als in warmen Klimazonen. Darüber hinaus werden sowohl Ancylostoma spp. als auch T. canis am häufigsten während der Sommersaison identifiziert. Die Analyse der Daten zeigt außerdem, dass 60,86 % der Rüden positiv auf Ancylostomiasis getestet wurden, während 37,38 % positiv auf Toxocariosis getestet wurden. Darüber hinaus wird T. canis häufiger bei Welpen im Alter von weniger als 6 Monaten nachgewiesen, während Ancylostoma spp. bei erwachsenen Hunden häufiger vorkommt. Interessanterweise wurden keine erkennbaren Unterschiede zwischen verschiedenen Hunderassen beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass 65,54 % der Hunde im Freien mit Hundehakenwürmern infiziert sind, während T. canis bei Haus- und Freigängern gleichermaßen verbreitet ist. *Mittelwerte innerhalb einer Spalte des Faktors (Klima, Jahreszeit, Geschlecht, Alter, Rasse und Haltung), gefolgt von denselben Buchstaben, unterscheiden sich laut ANOVA-Test bei P < 0,05 nicht signifikant.
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Discussion
Nematoden wie T. canis und Ancylostoma spp. können den Dünndarm von Hunden bewohnen und haben das Potenzial, auf den Menschen übertragen zu werden. Klinische Symptome, die durch T. canis verursacht werden, sind bei jungen Hunden schwerwiegend und äußern sich in schlechtem Wachstum, Atemproblemen oder Läsionen des Verdauungstrakts28. Bei erwachsenen Hunden verläuft die Infektion in der Regel mild. Die Diagnose beruht auf der Identifizierung charakteristischer Eier in einer Kotprobe. Dieser Zustand ist eine häufige Ursache für die Verschreibung einer Anthelminthika-Behandlung an Hunde29. Um die Epidemiologie von Toxocara zu verstehen, ist es wichtig zu erkennen, dass der Parasit sowohl durch die Plazenta vor der Geburt als auch durch das Saugen als galaktogene Infektion kurz nach der Geburt von der Mutter auf den Welpen übertragen werden kann. Menschen können sich bei der Aufnahme infektiöser Eier mit T. canis infizieren, was auf verschiedene Weise wie kontaminierter Boden oder das Fell eines infizierten Hundes geschehen kann. In diesem Fall dient der Mensch als paratenischer Wirt, und obwohl es keine parasitäre Fortpflanzung gibt, können die freigesetzten Larven aus den Eiern möglicherweise Schaden anrichten, insbesondere bei Kindern30.
Eine Infektion mit dem Hakenwurm Ancylostoma spp. bei Hunden tritt auf, wenn die Tiere die Larven aufnehmen oder wenn Larven in die Haut eindringen. Welpen können sich die Infektion durch den Verzehr eines paratenischen Wirts oder über den laktogenen Wegzuziehen 31. Reife Hakenwürmer ernähren sich von Blut, was insbesondere bei jungen Hunden zu schwerer Anämie und Magen-Darm-Symptomen führen kann. Infektionen, die über die Haut auftreten, führen zu einer Dermatitis, die in der Regel etwa eine Woche nach Ausbruch der Infektion abklingt. Es wurden verschiedene Anthelminthika eingesetzt, begleitet von einer unterstützenden Therapie. Es gibt jedoch Berichte über Anthelminthika-Resistenzen. Ancylostoma hat das Potenzial, für den Menschen pathogen zu sein. Die transkutane Übertragung von L3-Larven kann zu einer Erkrankung führen, die als kutane Larva migrans bekannt ist. Diese Läsionen klingen in der Regel ohne Behandlung über einige Monate ab. In seltenen Fällen können die Hundehakenwürmer in den menschlichen Magen-Darm-Trakt wandern und eine eosinophile Enteritisauslösen 30.
Die genaue, wirtschaftliche und schnelle Diagnose von Parasitose bei Hunden ist unerlässlich, um unser epidemiologisches Wissen über Helminthiasen bei Hunden zu erweitern. Aus diesem Grund haben wir ein Protokoll der einfachen Flotationstechnik angepasst, das in einer Feldumgebung zum Nachweis von T. canis und Ancylostoma spp. verwendet werden kann. Ein relevantes Problem im aktuellen Protokoll war die Entnahme von Proben von verwilderten Hunden, da diese Tiere in der Regel schwer zu handhaben sind. Daher wurde die Probenahme durchgeführt, indem die Hunde beobachtet und bis zum Stuhlgang verfolgt wurden, was die Probenahmemethode zeitaufwändig, herausfordernd und irgendwie gefährlich machte. Nach unserer Erfahrung empfehlen wir dringend, parasitologische Studien an Tierheimhunden durchzuführen.
In Bezug auf die zoonotische Gewinnung von Helmintheneiern ist die qualitative Koproskopie nach wie vor die im Parasitologielabor übliche Methode für diagnostische Zwecke1. Frühere Studien haben ergeben, dass die Flotationstechnik mit einer gesättigten Salzlösung zuverlässiger ist als die direkte Mikroskopie. Zum Beispiel bestimmten Dryden und Mitarbeiter eine Sensitivität von 95,15 % für Ancylostoma spp.-Eier in 206 Kotproben, die mit der Flotationstechnik verarbeitet wurden, und 27,18 % durch direkte Mikroskopie32. Es wird anerkannt, dass die Dichte der Flotationslösung ein kritischer Faktor für das Flotationsverfahrenist 14,20,23. In Lösungen, die diese Dichte nicht erreichen, brauchen die parasitären Formen länger, um zu schwimmen oder schwimmen nie. Wenn eine Flotationslösung übersättigt ist, kristallisiert sie in ein paar Minuten und noch früher, wenn ein Deckglas platziert wird20.
Die Wahl der Flotationslösung in diesem Protokoll basierte auf einfacher Vorbereitung, Bequemlichkeit, Kosten und Umweltverträglichkeit. Auch wenn die Kristallisation der Zuckerlösung länger dauert, sollte Formalin oder Phenol als Konservierungsmittel hinzugefügt werden, um das klebrige oder klebrige Gefühl zu verringern. was unter den Feldbedingungen, die in dieser Studie vorherrschten, eine Unannehmlichkeit ist. Darüber hinaus ist die Entsorgung chemischer Reagenzien aufgrund von Umweltvorschriften ein komplexes Thema. Die Daten in dieser Studie zeigten, dass die gesättigte Lösung, die unter Feldbedingungen unter Verwendung einer Sodaflasche hergestellt wurde, da Laborgeräte zur Herstellung und zum Kochen einer Flotationslösung nicht verfügbar waren, genauso wirksam war wie die in einer Laborumgebung hergestellte. Der einzige wahrnehmbare Unterschied besteht darin, dass die Limonadenflasche länger geschüttelt wird, bis eine transparente Lösung zu sehen ist. Mikroskopische Beobachtungen waren für die Probe, die mit beiden Methoden zur Herstellung der gesättigten Lösung hergestellt wurde, gleich sauber. Es ist wichtig, in Zukunft mehr Studien mit einer größeren Anzahl von Proben durchzuführen, um die oben genannte Aussage zu bestätigen. Es ist jedoch zeitaufwändig und erfordert die körperliche Anstrengung, die Lösung stundenlang in der Flasche zu schütteln. Ein weiterer kritischer Schritt des Protokolls besteht darin, die Kotsuspension mindestens 15 Minuten stehen zu lassen, damit die Eier schwimmen und sich auf der Oberfläche konzentrieren können. Je länger die Ruhezeit ist, desto mehr Schmutz schwimmt jedoch und nach einigen Stunden verformen oder brechen die Eier. In Anbetracht der Tatsache, dass die Sensitivität und Spezifität koproparasitoskopischer Methoden gering ist und die Genauigkeit dieser Methoden als diagnostische Tests von den Fähigkeiten des Benutzers abhängt, führten in der aktuellen Studie geschulte und erfahrene Parasitologen die Flotationstechnik durch und identifizierten die Parasiten.
Diese Studie ist unseres Wissens die erste, die die Prävalenz von Ancylostoma spp. und T. canis bei Hunden in Mexiko anhand von Kotproben abschätzt, die mit der einfachen Flotationsmethode im Feld untersucht wurden. Hier wurde gezeigt, dass die von uns verwendete Flotationstechnik trotz ihrer jahrzehntelangen Anwendung immer noch ein hochwirksamer, wirtschaftlicher und schneller diagnostischer Test ist14. Trotzdem gibt es koproparasitoskopische Techniken mit höherer Sensitivität und Spezifität als die, die wir für die Diagnose von Hundehelminthen verwendet haben; wie z.B. die Sedimentationskonzentration, wie es bei der Faust-Technik der Fall ist. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass Faust, eine Konzentrationsmethode, sich auch als effektiver beim Nachweis von Protozoen wie Giardia33 erwiesen hat. Nichtsdestotrotz hatte die koproparasitoskopische Methode, die wir für diese Studie gewählt haben, mehrere Vorteile, wie z. B. die Kosten. Die Faust-Technik ist teurer als die Flotation mit salzgesättigter Lösung, da sie zusätzliche und teure Geräte wie eine Zentrifuge erfordert. Andere Konzentrationsmethoden, z. B. mit Reagenzien wie Zinksulfat, sind teurer als Kochsalz und benötigen aufgrund der Anzahl der erforderlichen Waschgänge in der Zentrifuge mehr Zeit. Daher ist die Faust-Technik für den Einsatz in der Feldarbeit begrenzt, wo kein Zugang zu einer Zentrifuge üblich ist.
Am wichtigsten ist, dass eine Einschränkung der einfachen Flotationstechnik darin besteht, dass sie nicht empfindlich genug ist, um Cryptosporidium-Oozysten , Giardia-Zysten oder Trichuris-Eier zu erkennen. Techniken mit Zentrifugationsverfahren zur Konzentration von Parasitenformen sollten daher verwendet werden, wenn die Diagnose dieser Arten beabsichtigt ist. Es ist wichtig hervorzuheben, dass die Positivitätsraten der in dieser Studie berichteten Gattungen nicht als schlüssig angesehen werden sollten, da eine Convenience-Methode als Stichprobenstrategie verwendet wurde. Es ist wichtig zu beachten, dass es Situationen geben kann, wie z. B. in Tierheimen mit anspruchsvollem Tiermanagement, in denen es entscheidend wird, Helminthenparasiten bei Hunden zu identifizieren. Infolgedessen muss dieses Protokoll möglicherweise in Zukunft angepasst werden, um die Entnahme kombinierter Proben zu ermöglichen.
Als Schwachpunkt ist anzumerken, dass die einfache Flotationsmethode und die Herstellung der gesättigten NaCl-Lösung für einen bestimmten Zweck entwickelt wurden - die Untersuchung von Hundekot unter hauptsächlich Feldbedingungen -, aber die Empfindlichkeit des einfachen Flotationsverfahrens wurde im Allgemeinen als gering angesehen. Um Zysten oder Eier schwererer Parasitenarten zu erkennen, wird daher dringend die Verwendung einer Konzentrationstechnik empfohlen. Angesichts der geringen Empfindlichkeit der einfachen Flotationsmethode, unabhängig davon, ob sie in einer Feld- oder Laborumgebung durchgeführt wird, war es vernünftig zu bezweifeln, dass diese Technik als Methode der Wahl für epidemiologische Studien an caninen Helminthenparasiten nützlich sein würde. Nichtsdestotrotz deuten die hohe Prävalenz von Ancylostoma spp. bei Hunden in dieser Studie und der Nachweis von T. canis-Eiern darauf hin, dass die einfache Flotationsmethode, unabhängig davon, ob sie im Freiland oder im Labor durchgeführt wird, nützlich ist, um Beweise zu liefern, die weitere epidemiologische Studien unterstützen und Kontroll- und Präventionsmaßnahmen vorschlagen könnten, um die Infektion von Hunden und Menschen mit diesen Nematoden zu reduzieren.
Mit der einfachen Flotationsmethode analysierten wir die Faktoren, die die Gewinnung von T. canis- und Ancylostoma spp.-Eiern aus Hundekot beeinflussen. Die Ergebnisse von T. canis stimmten mit den neuesten Forschungsergebnissen überein, die darauf hindeuten, dass Parasiten in gemäßigten und tropischen Regionen deutlich häufiger vorkommen. Dies deckt sich mit früheren Studien, die untersucht haben, wie Umweltfaktoren, insbesondere Temperatur und Niederschlag, das ökologische Verbreitungsgebiet von Parasitenarten beeinflussen 34,35,36. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass beide Helminthen Männchen in einem signifikant höheren Anteil infizieren. Es ist vernünftig zu spekulieren, dass dieser Befund darauf zurückzuführen ist, dass Männer immunologisch weniger auf Infektionen reagieren37,38. Das Alter beeinflusst die Prävalenz von T. canis, da Welpen stärker von diesem Parasiten betroffen waren. Dieser Befund deckt sich mit früheren Forschungsergebnissen, die darauf hindeuten, dass dieser Parasit dazu neigt, Welpen stärker zu befallen, während Erwachsene eine erhöhte Resistenz entwickeln, was zu einer geringeren Infektionswahrscheinlichkeit führt 6,39. Sowohl gekreuzte als auch reinrassige Hunde zeigten vergleichbare Prävalenzen von Toxocara canis und Ancylostoma spp. Verwilderte Hunde wiesen jedoch eine höhere Prävalenz von Ancylostoma spp. auf als Hunde, die in häuslichen Umgebungen lebten. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu früheren Berichten, die keine Unterschiede zwischen Hunderassen feststellten6. Daraus lässt sich schließen, dass zukünftige Anwendungen der Herstellung der gesättigten Kochsalzlösung und der in diesem Protokoll verwendeten einfachen Flotationsmethode für routinemäßige Stuhluntersuchungen unter Feld- oder Laborbedingungen durchgeführt werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Dirección General de Asuntos del Personal Académico der Universidad Nacional Autónoma de México für die Bereitstellung der finanziellen Mittel durch das Stipendium PAPIIT IN218720 und Dr. Claudia Mendoza für die Gewährung der beantragten Verlängerung. Dieses Werk ist meiner lieben Nicole gewidmet, die 2019 verstorben ist. Du wirst immer in meinem Herzen leben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
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