Summary
Protein-protein-interaksjoner er viktige for å belyse funksjonen til målproteiner, og co-immunoprecipitation (co-IP) kan lett bekrefte PPI. Vi transfektet forbigående et plasmid som koder for et epitopmerket protein til HEK-293-celler og utviklet en immunutfellingsmetode for enkelt å bekrefte bindingen av to målproteiner.
Abstract
Protein-protein-interaksjoner (PPI) spiller en sentral rolle i biologiske fenomener, som cellulær organisasjon, intracellulær signaltransduksjon og transkripsjonsregulering. Derfor er forståelse av PPI et viktig utgangspunkt for videre undersøkelse av funksjonen til målproteinet. I denne studien foreslår vi en enkel metode for å bestemme bindingen av to målproteiner ved å introdusere pattedyrekspresjonsvektorer i HEK-293-celler ved hjelp av polyetyleniminmetoden, lysere cellene i hjemmelaget proteinlysisbuffer og trekke ned målproteinene på en epitopmerkeaffinitetsgel. I tillegg kan PPI mellom de forskjellige epitopmerkede smeltede proteinene bekreftes ved å bruke affinitetsantistoffer mot hver tag i stedet for epitopmerket affinitetsgel. Denne protokollen kan også brukes til å verifisere ulike PPIer, inkludert kjernefysiske ekstrakter, fra andre cellelinjer. Derfor kan den brukes som en grunnleggende metode i en rekke PPI-eksperimenter. Proteiner nedbrytes ved lengre tidsforløp og gjentatte fryse-tine-sykluser. Derfor bør cellelyse, immunutfelling og immunblotting utføres så sømløst som mulig.
Introduction
Proteiner spiller en viktig rolle i alle cellulære funksjoner, inkludert informasjonsbehandling, metabolisme, transport, beslutningstaking og strukturell organisering. Proteiner formidler sine funksjoner ved å samhandle fysisk med andre molekyler. Protein-protein-interaksjoner (PPI) er viktige for formidling av cellulære funksjoner, for eksempel formidling av signaltransduksjon, sensing av miljøet, konvertering av energi til fysisk bevegelse, regulering av aktiviteten til metabolske og signalerende enzymer og opprettholdelse av cellulær organisasjon1. Dermed kan PPI brukes til å belyse ukjente funksjoner2. Metoder for å oppdage PPI kan klassifiseres i tre typer: in vitro, in vivo og i silico. Koimmunopresipitasjon (co-IP), affinitetskromatografi, tandemaffinitetsrensing, proteinmatriser, fagdisplay, proteinfragmentkomplementering, røntgenkrystallografi og kjernemagnetisk resonansspektroskopi har blitt brukt til in vitro PPI-deteksjon 3. Blant disse metodene er co-IP mye brukt på grunn av sin enkelhet.
Fusjonsmerket FLAG består av åtte aminosyrer (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), inkludert et enterokinasespaltningssted, og ble spesielt utviklet for immunoaffinitetskromatografi4. DYKDDDDK-merkede proteiner gjenkjennes og fanges opp ved hjelp av et anti-DYKDDDDK-antistoff. Derfor trekkes de effektivt ned ved hjelp av DYKDDDDK-bindende agaroseperler5 for å bekrefte bindingen til spesifikke proteiner på en enkel måte. Immunutfelling kan utføres i en rekke celler, og et bredt spekter av PPI kan bekreftes ved hjelp av antistoffer mot proteinet av interesse. Immunutfelling og peptideluering med anti-DYKDDDDK agaroseperler er tidligere rapportert5.
Her gir vi en enkel immunutfellingsmetode der et plasmid som koder for et DYKDDDDK-merket protein blir forbigående introdusert i HEK-293-celler for å bekrefte sammenhengen mellom to proteiner av interesse. Visse DYKDDDDK-antistoffer kan binde seg til både N-terminalen og C-terminalen av fusjonsproteinene, men ikke andre6. Derfor, for å unngå forvirring, bør antistoffet som gjenkjenner taggen smeltet til både N- og C-terminalen velges. Når du setter inn en epitopkode, kan det være mulig å unngå konformasjonsendringer i proteinet ved å sette inn 3 til 12 basepar mellom epitopmerket og målproteinet. Den innsatte sekvensen bør imidlertid være et basepar i multipler på 3 for å unngå rammeforskyvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1 viser en oversikt over protokollen.
1. Klargjøring av løsninger og buffere
- Proteinlysebuffer: Forbered proteinlysebufferen etter en tidligere publisert rapport7 (tabell 1).
- Proteinlysebuffer + proteasehemmer (PI): Legg til proteasehemmer (se materialtabell) til den ovenfor forberedte bufferen (trinn 1.1). Oppbevares ved -20 °C.
- Prøvebuffer: Bland 900 mikrol 4x Laemmli prøvebuffer (se materialfortegnelse) og 100 mikrol 2-merkaptoetanol. Oppbevares ved -20 °C.
- Fosfatbufret saltvann (PBS) med polyoksyetylen (20) sorbitanmonolaurat (PBS-P): Bland 1,998 liter PBS og 2 ml polyoksyetylen (20) sorbitanmonolaurat (se materialtabell). Oppbevares i romtemperatur.
- 1x Tris / Glycine / SDS buffer: Bland 450 ml DDW og 50 ml 10x Tris / Glycine / SDS. Forbered deg ved romtemperatur på bruksdagen.
2. Plasmid transfeksjon
- Kultur HEK-293 celler i en 10 cm kollagenbelagt tallerken til subkonfluens (80% -95%) ved bruk av Dulbeccos modifiserte ørnemedium som inneholder 10% føtal bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (10.000 enheter / ml penicillin G og 10.000 μg / ml streptomycin) (se materialtabellen).
- Forbered 1-10 μg plasmid7 som skal transfeksjoneres per tallerken og lag en transfeksjonsblanding. Tilsett 150 mM NaCl til et endelig volum på 250 μL per tallerken. Vortex og spinn ned blandingen.
- Tilsett 60 μL 1 mg/ml polyetylenimin (PEI, se materialfortegnelse) per tallerken, etterfulgt av 150 mM NaCl til et endelig volum på 250 μl PEI-oppløsning.
- Tilsett PEI-løsningen til transfeksjonsblandingen for å lage en blandet løsning. Umiddelbart virvel (ved toppfart i 3-5 s, utfør det samme deretter) og spinn ned.
- Inkuber ved romtemperatur i 15-30 min. I løpet av denne tiden, endre mediet av HEK-293-celler.
- Dryss 500 μL / tallerken med blandet løsning over hele fatet av HEK-293 celler og inkuber over natten (13-14 timer).
- Utfør middels bytte neste dag.
3. Cellelyse og prøvepreparering
MERK: For å unngå nedbrytning av protein, bør de påfølgende trinnene utføres uten konservering eller frysing av prøven så mye som mulig.
- Ca. 48 timer etter transfeksjon, vask cellene tre ganger med iskald PBS, tilsett 500 μL / tallerken proteinlysebuffer + PI, og samle cellene ved celleskraper og en pipette i et rør med lav proteinadsorpsjon på is.
- Virvel hvert 5 min og rug prøvene på is i 10 min.
- Sentrifuge ved 16 400 x g i 10 minutter ved 4 °C. Samle supernatanten og overfør den til et friskt 1,5 ml rør med lav proteinadsorpsjon. Prøvene kan oppbevares ved -80 °C.
- Bestem proteinkonsentrasjonen av prøvene med et målesett for proteinkonsentrasjon i henhold til produsentens protokoll (se materialtabell).
- Separat 200-1000 μg av samme mengde protein i hver prøve, og tilsett deretter proteinlysebuffer + PI for å justere totalvolumet til 500-1000 μL.
MERK: Følgende trinn utføres på is.
4. Tilberedning av slurry
MERK: Forbered en 1: 1 oppslemming av protein G gel og epitop tag affinitet gel dagen før eller på dagen for immunutfelling.
- Fremstilling av et protein G gel
- Bruk en spiss med enden avskåret, bland godt og separer deretter protein G-gelen (se materialtabellen) slik at 20 μL perler per prøve fremstilles.
- Sentrifuge ved 12 000 x g i 20 s ved 4 °C og legg kulene på is i 1 min slik at kulene flater ut. Kast supernatanten med en pipette.
- Tilsett 1 ml proteinlysebuffer + PI til proteinet G-gel fremstilt i trinn 4.1.2 og bland ved å banke og snu. Sentrifuge ved 12 000 x g i 20 s ved 4 °C, legg kulene på is i 1 min slik at kulene flater ut, og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 4.1.3 tre ganger.
- Tilsett et likt volum proteinlysebuffer til proteinet G-gel for å lage en 1: 1 protein G-geloppslemming. Protein G-geloppslemmingen kan oppbevares ved 4 °C i ca. 1 dag.
- Fremstilling av en affinitetsgel for epitopmerke
- Bruk en spiss med enden avskåret, beveg godt og separer deretter epitopmerket affinitetsgel (se materialfortegnelse) slik at 10-15 μL perler per prøve fremstilles.
- Sentrifuger ved 5000 x g i 30 s ved 4 °C og vent i 1 min på is for å la kulene flate ut. Kast supernatanten med en pipette.
- Tilsett 1 ml proteinlysebuffer + PI til epitopmerket affinitetsgel klargjort i trinn 4.2.2 og bland ved å banke og invertere. Sentrifuge ved 5000 x g i 30 s ved 4 °C, legg kulene på is i 1 min slik at kulene flater ut, og kast supernatanten med en pipette.
- Gjenta trinn 4.2.3 to ganger.
- Tilsett 500 μL 0,1 M glycin (pH 3,5) til epitopmerket affinitetsgel fremstilt i trinn 4.2.4 og bland ved å banke og invertere. Dette trinnet utføres for å fjerne antistoffer med fri epitopmerke. Innen 20 minutter etter tilsetning av glycin, sentrifuge ved 5000 x g i 30 s ved 4 °C, legg perlene på is i 1 min for å la kulene flate ut, og kast supernatanten.
- Tilsett 500 μL proteinlysebuffer + PI til epitopmerket affinitetsgel klargjort i trinn 4.2.5 og bland ved å banke og invertere. Sentrifuge ved 5000 x g i 30 s ved 4 °C, legg kulene på is i 1 min slik at kulene flater ut, og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 4.2.6 tre ganger.
- Legg til et likt volum proteinlysisbuffer til affinitetsgelen for epitopmerket for å forberede en 1:1-epitopmerkeaffinitetsgeloppslemming. Epitope tag affinity gel slurry kan oppbevares ved 4 °C i ca. 1 dag.
5. Preclearing med protein G-gelen og fangst av proteinkomplekser med epitopmerket affinitetsgel
- Bland 1:1 protein G-slam (tilberedt i trinn 4) med en pipette påsatt en kuttspiss og tilsett 40 μL om gangen til prøven.
- Roter prøven i 1 time på en rotator (se materialfortegnelse) på ca. 30 s per syklus i et kjølekammer (4 °C).
- Sentrifuge ved 12 000 x g i 20 s ved 4 °C og legg kulene på is i 1 min slik at kulene flater ut.
- Samle supernatanten og overfør den til et nytt 1,5 ml rør med lav proteinadsorpsjon.
- Separer prøven for inndata fra prøven i trinn 5.4 og overfør den til et nytt 1,5 ml rør.
- Tilsett 20-30 μL av 1: 1 epitop tag gel slurry til prøven.
- Roter på en rotator i ca. 30 s per syklus i et kjølekammer (4 °C) i 2 timer.
- Tilsett prøvebuffer til inngangen som ble klargjort i trinn 5.5 for å fortynne den til 4x, og varm opp ved 98 °C i 10 minutter. Inngangen kan lagres ved -80 °C.
MERK: På grunn av muligheten for proteinnedbrytning på grunn av frysing og tining, bør etterfølgende trinn utføres uten å bevare proteinet så mye som mulig.
6. Vask og eluering av utfelte proteiner
- Sett temperaturen på varmeblokken til 98 °C.
- Sentrifuger ved 5000 x g i 30 s ved 4 °C og vent i 1 min på is for å la kulene flate ut. Kast supernatanten med en pipette.
- Tilsett 1 ml proteinlysebuffer + PI og bland ved å banke og invertere. Roter på en rotator i ca. 30 s per syklus i et kjølekammer (4 °C) i 5 minutter. Sentrifuge ved 5000 x g i 30 s ved 4 °C, vent i 1 min på is for å la kulene flate ut, og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 6.3 5-10 ganger.
- Tilsett 10 μL prøvebuffer til prøven fremstilt i trinn 6.4. Kok ved 98 °C i 10 min.
- Sentrifuge ved 5000 x g ved 4 °C i 30 s.
- Plasser en kolonne i et nytt rør med lav proteinadsorpsjon og overfør gelen til kolonnen ved hjelp av en pipette med en kuttspiss. En kolonne brukes for å unngå forurensning av gelen.
- Sentrifuge ved 9 730 x g i 1 min ved 4 °C. Samle gjennomstrømningen. Prøven kan oppbevares ved -80 °C.
MERK: Hvis nedbrytning av prøven er et problem, bør følgende immunoblotting utføres uten frysing.
7. Immunoblotting
MERK: Immunoblotting prosedyrer er basert på tidligere rapporter 7,8.
- Legg hele prøver på en natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel (SDS-PAGE, se materialtabell).
MERK: Bruk om nødvendig geler med store brønner slik at hele prøven kan overføres. Geler med 50 μL brønner ble brukt her. - Sett gelene i elektroforesekammeret og tilsett 1x Tris / Glycin / SDS-buffer (se materialtabell) opp til riktig volum rundt gelene.
- Elektroforesende geler ved 100 V og 400 mA.
- Overføring til polyvinylidenfluorid (PVDF, se materialtabell) membraner.
- Blokker PVDF-membranflekkene med 5% skummet melk i PBS-P i 1 time ved romtemperatur.
- Vask membranen tre ganger med PBS-P på en shaker i toppfart i 5 min. Utfør samme prosedyre deretter når du vasker.
- Inkuber over natten på en shaker med det primære antistoffet (se materialfortegnelse) ved 4 °C.
- Vask membranen tre ganger med PBS-P neste dag.
- Inkuber i 1 time med det sekundære antistoffet på en shaker ved romtemperatur.
MERK: Hvis molekylvekten til målproteinet er nær den tunge IgG-kjeden, som har en molekylvekt på ca. 50 kDa, kan et lettkjedespesifikt sekundært antistoff brukes for å unngå overlapping av målbåndet med den tunge IgG-kjeden. Denne studien brukte lettkjedespesifikke antistoffer7 eller Veriblot som IP-deteksjonsreagens (se materialtabellen). - Identifiser bånd av proteiner med peroksidase luminescerende substrater. Membranen kan lagres i PBS etter vask to ganger med PBS-P.
- Strip i 10 minutter med en strippeløsning (se materialfortegnelse).
- Vask tre ganger og blokker med 5% skummet melk i PBS-P. Protokollen deretter er den samme som i trinn 7.6 og utover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termogene adipocytter, også kjent som brune og beige adipocytter, har potensielle anti-fedme og anti-glukoseintoleranse effekter. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homolog) domeneholdig 16 (PRDM16) er en transkripsjonskofaktor som spiller en viktig rolle i å bestemme termogen adipocyttidentitet 9,10.
EHMT1 (eukromatisk histon-lysin N-metyltransferase 1), også kjent som GLP, katalyserer primært mono- og dimetyleringen av lysin 9 av histon H3 (H3K9) ved bruk av kofaktoren S-adenosylmetionin 11. En tidligere rapport indikerte at EHMT1 er en essensiell metyltransferase i PRDM16-komplekset som styrer termogen fettcelleskjebne gjennom histonmetylering12,13. Videre har vi tidligere rapportert at ekspresjonsnivåene av PRDM16 og EHMT1 er signifikant korrelert med termogene gener i humant perirenalt brunt fettvev (BAT), noe som tyder på at både PRDM16 og EHMT1 spiller viktige roller i human BAT-utvikling8.
For å demonstrere effektiviteten til denne protokollen som en metode for å bekrefte PPI, transfektet vi DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1 til HEK-293-celler og immunutfelte DYKDDDDK-PRDM16 ved hjelp av protokollen ovenfor. DYKDDDDK-merket PRDM16 og HA-merket EHMT1 ble satt inn i kloningsstedene til pattedyruttrykksvektoren pcDNA3.1 (se materialfortegnelse). Immunoblotting bekreftet assosiasjonen mellom DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1 i grupper transfektert med DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1 (figur 2).
Figur 1 Skjematisk fremstilling av koimmunutfelling. Skjemaet til protokollen er vist her. Høyre side viser arbeidsflyten til protokollen; Venstre side viser en grafisk fremstilling av reaksjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: PRDM16 assosierer med EHMT1. HEK-293-celler ble transfeksjonert med vektor (negativ kontroll), DYKDDDDK-PRDM16 eller DYKDDDDK-PRDM16 og HA-EHMT1. Co-immunoprecipitation ble deretter utført ved hjelp av en DYKDDDDK tag affinity gel, etterfulgt av immunoblotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Proteinlysebuffer 250 ml (0,22 μm filtrering, oppbevares ved 4 °C) | ||
| Ml | Endelig konsentrasjon | |
| 1 m tris pH 8,0 | 12.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 7.5 | 150 mM |
| 0,5 m etylendiamintetraeddiksyre | 0.5 | 1 mM |
| Glyserol | 25 | 10% |
| Polyoksyetylen(10) oktylfenyleter | 2.5 | 1% |
| DDW | 202 | |
| Total | 250 | |
Tabell 1: Sammensetning av proteinlysebuffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er nesten som tidligere rapporterte protokoller 5,7,14,15. Det viktige poenget med denne protokollen er at vi aldri stopper eksperimentet fra cellelysetrinnet til immunutfellingstrinnet. Proteinnedbrytning hindrer PPI-deteksjon. Utvidet tidsforløp og gjentatte fryse-tine-sykluser nedbryter proteiner. Elektroforese i SDS-PAGE bør også utføres samme dag med immunutfelling, ikke bare for å minimere proteinnedbrytning, men også for å maksimere PPI-deteksjon.
I termogene adipocytter ble interaksjonen mellom EHMT1 og PRDM16 rapportert i en tidligere studie13. EHMT1 - PRDM16-komplekset regulerer brun adipocytcelleskjebne og termogenese13. EHMT1 får PRDM16 til å stabilisere seg ved å avbryte interaksjonen mellom PRDM16 - Amyloid proteinbindende protein (APPBP) 216. Denne PRDM16-stabiliseringen er regulert av cullin(CUL) 2-APPBP2 og EHMT116.
I denne studien ble HEK-293-celler brukt fordi HEK-293-celler er mye brukt i produksjonen av rekombinante proteiner17. Andre cellelinjer som er enkle å transfektere med plasmider kan brukes, for eksempel Cos-7-celler og Hela-celler. PEI ble brukt til transfeksjon fordi PEI er mer økonomisk og enklere sammenlignet med konvensjonell lipofeksjon.
Preclearing, rotasjon i en epitopmerkeaffinitetsgel og vasking er spesielt viktige trinn i denne metoden. Preclearing kan fjerne proteinene som binder seg ikke-spesifikt til gelen. I tillegg er tiden for rotasjon med affinitetsgelen for epitopmerket viktig fordi overdreven tid kan resultere i uspesifikk proteindeteksjon, og utilstrekkelig tid kan hindre deteksjonen av målproteinene.
Følgende punkter bør noteres. HEK-293 celler løsner lett; Derfor bør kollagenbelagte retter brukes ved tilberedning av prøvene. PEI-oppløsning er cytotoksisk; Derfor bør mediet byttes ut etter transfeksjon uten å forlate cellene i lengre tid. Hvis PPI ikke observeres, kan mengden transfekterte plasmider være utilstrekkelig og/eller mengden protein som bringes inn i IP kan være lav. I tillegg, hvis antall vasker er overdreven, kan interaksjonene bli savnet. For å løse disse kan følgende vurderes: øke mengden plasmid introdusert i HEK-293-celler, øke mengden protein som brukes til IP, og redusere antall vasker. Videre, hvis for mye supernatant er igjen i den endelige vasken, vil den renne over fra brønnene til natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelen. Hvis uspesifikke bånd observeres, kan mengden plasmid/protein som brukes til IP være for høy, eller antallet eller intensiteten på vaskene kan være utilstrekkelig. Disse kan løses ved å redusere mengden plasmid/protein som brukes til IP, øke antall vasker eller øke vaskekraften ved å øke saltkonsentrasjonen i vaskebufferen.
Vanlige vaskemidler som polyoksyetylen (10) oktylfenyleter kan forstyrre funksjonelt signifikante PPI18. Mildere vaskemidler kan øke utvinningen av funksjonelt viktige komplekser, mens de kan gi et uakseptabelt nivå av uspesifikke interaksjoner på grunn av ufullstendig oppløseliggjøring. Proteinlysebufferen som brukes i denne studien inneholder 1% polyoksyetylen (10) oktylfenyleter. Denne bufferen lyser cytoplasmatiske proteiner med høye mengder proteiner overuttrykt av de transfekterte plasmidene. Når immunutfelling utføres på prøver fremstilt ved å separere kjerner og cytoplasma, reduseres bakgrunnen sammenlignet med prøver fremstilt ved helcellelyse, og klare målbånd kan identifiseres17. Hvis immunoprecipitation utføres med proteiner i kjernen, kan nukleære proteiner ekstraheres ved hjelp av et kommersielt nukleært ekstraksjonssett eller ved å ødelegge og fjerne cytoplasma med lav saltbuffer inneholdende vaskemiddel og deretter ekstrahere nukleære proteiner med høy saltbuffer19. Utviklingstiden i immunoblotting bør justeres ikke bare for å unngå bakgrunn, men også for å oppdage visse bånd.
Denne metoden hadde flere begrensninger. Først brukte vi en PPI som er svært forventet å oppdage. For det andre, fordi uttrykket av hvert gen avhenger av kombinasjonen av plasmider, kan utilstrekkelig protein oppnås, og interaksjonen kan derfor ikke oppdages.
Oppsummert, ved hjelp av denne metoden, kan PPI bekreftes økonomisk og enkelt sammenlignet med massespektrometri. PPI mellom de forskjellige epitopmerkede smeltede proteinene kan også bekreftes ved å bruke affinitetsantistoffer mot hver tag i stedet for epitopmerket affinitetsgel. Lignende immunutfellingsmetoder kan utføres i andre celletyper ved å introdusere et plasmid som uttrykker ethvert protein smeltet til DYKDDDDK-taggen. Videre gjør bruk av endogene antistoffer i stedet for en epitopmerkeaffinitetsgel det mulig å bekrefte endogene PPI i forskjellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi erklærer at ingen av forfatterne har noen interessekonflikter knyttet til denne studien.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.), og MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
- Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
- Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
- Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
- Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
- Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
- Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
- Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
- Cristea, I. M., Chait, B. T.
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
- Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
- Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).
