Summary
Белок-белковые взаимодействия важны для выяснения функции белков-мишеней, а ко-иммунопреципитация (co-IP) может легко подтвердить ИПП. Мы временно трансфицировали плазмиду, кодирующую белок, помеченный эпитопом, в клетки HEK-293 и разработали метод иммунопреципитации, чтобы легко подтвердить связывание двух белков-мишеней.
Abstract
Белок-белковые взаимодействия (ИПП) играют ключевую роль в биологических явлениях, таких как клеточная организация, внутриклеточная передача сигналов и регуляция транскрипции. Таким образом, понимание ИПП является важной отправной точкой для дальнейшего исследования функции белка-мишени. В этом исследовании мы предлагаем простой метод определения связывания двух белков-мишеней путем введения экспрессирующих векторов млекопитающих в клетки HEK-293 с помощью метода полиэтиленимина, лизирования клеток в самодельном буфере для лизиса белка и извлечения целевых белков на гель аффинности эпитопной метки. Кроме того, ИПП между различными белками, слитыми с эпитопными метками, может быть подтвержден путем использования аффинных антител против каждой метки вместо аффинного геля эпитопной метки. Этот протокол также может быть использован для проверки различных ИПП, включая ядерные экстракты, из других клеточных линий. Поэтому его можно использовать в качестве основного метода в различных экспериментах с ИПП. Белки разрушаются при длительном протекании времени и повторяющихся циклах замораживания-оттаивания. Поэтому лизис клеток, иммунопреципитация и иммуноблоттинг должны выполняться как можно более плавно.
Introduction
Белки играют важную роль во всех клеточных функциях, включая обработку информации, метаболизм, транспорт, принятие решений и структурную организацию. Белки опосредуют свои функции, физически взаимодействуя с другими молекулами. Белок-белковые взаимодействия (ИПП) важны для опосредования клеточных функций, таких как опосредование передачи сигналов, восприятие окружающей среды, преобразование энергии в физическое движение, регулирование активности метаболических и сигнальных ферментов и поддержание клеточнойорганизации. Таким образом, ИЦП могут быть использованы для выяснения неизвестных функций2. Методы выявления ИПП можно разделить на три типа: in vitro, in vivo и in silico. Для обнаружения ИПП in vitro использовали ко-иммунопреципитацию (co-IP), аффинную хроматографию, тандемную аффинную очистку, белковые матрицы, фаговый дисплей, комплементацию белковых фрагментов, рентгеновскую кристаллографию и спектроскопию ядерного магнитного резонанса3. Среди этих методов со-ИС широко используется из-за своей простоты.
Фьюжн-метка FLAG состоит из восьми аминокислот (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), включая сайт расщепления энтерокиназы, и была специально разработана для иммуноаффинной хроматографии4. Белки, меченные DYKDDDDK, распознаются и захватываются с помощью антитела против DYKDDDDK. Поэтому они эффективно удаляются с помощью связывающих шариков агарозы5 DYKDDDDK для простого подтверждения их связывания с определенными белками. Иммунопреципитация может быть выполнена в различных клетках, и широкий спектр ИПП может быть подтвержден с помощью антител против интересующего белка. Ранее сообщалось об иммунопреципитации и элюировании пептидов с помощью анти-DYKDDK агарозных гранул5.
Здесь мы предлагаем простой метод иммунопреципитации, в котором плазмида, кодирующая белок, меченный DYKDDDDK, временно вводится в клетки HEK-293 для подтверждения ассоциации двух представляющих интерес белков. Некоторые антитела DYKDDDDK могут связываться как с N-концом, так и с C-концом гибридных белков, ноне с другими 6. Поэтому, чтобы избежать путаницы, следует выбирать антитело, которое распознает метку, слитую как с N-, так и с C-концом. При вставке эпитопной метки можно избежать конформационных изменений в белке, вставив от 3 до 12 пар оснований между эпитопной меткой и белком-мишенью. Однако вставленная последовательность должна быть парой оснований, кратной 3, чтобы избежать сдвига кадра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
На рисунке 1 представлен обзор протокола.
1. Приготовление растворов и буферов
- Буфер для лизиса белка: Подготовьте буфер для лизиса белка в соответствии с ранее опубликованным отчетом7 (Таблица 1).
- Буфер для лизиса белка + ингибитор протеазы (PI): Добавьте ингибитор протеазы (см. Таблицу материалов) в вышеприготовленный буфер (шаг 1.1). Хранить при температуре -20 °C.
- Буфер для образцов: Смешайте 900 μл 4-кратного буфера для образцов Laemmli (см. Таблицу материалов) и 100 μл 2-меркаптоэтанола. Хранить при температуре -20 °C.
- Фосфатно-солевой буфер (PBS) с полиоксиэтиленом (20) монолауратом сорбитана (PBS-P): Смешайте 1,998 л PBS и 2 мл полиоксиэтилена (20) монолаурата сорбитана (см. Таблицу материалов). Хранить при комнатной температуре.
- 1x Трис/Глицин/SDS буфер: Смешайте 450 мл DDW и 50 мл 10x Трис/Глицин/SDS. Готовьте при комнатной температуре в день использования.
2. Плазмидная трансфекция
- Культивирование клеток HEK-293 в 10-сантиметровой чашке, покрытой коллагеном, до субконфлюенции (80%-95%) с использованием модифицированной среды Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина (10 000 ЕД/мл пенициллина G и 10 000 мкг/мл стрептомицина) (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте 1-10 г плазмиды7 для трансфекции на чашку и сделайте трансфекционную смесь. Добавьте 150 мМ NaCl в конечный объем 250 μл на чашку. Закрутите и раскрутите смесь.
- Добавьте 60 мкл 1 мг/мл полиэтиленимина (ПЭИ, см. Таблицу материалов) на чашку, а затем 150 мМ NaCl до конечного объема 250 мкл раствора ПЭИ.
- Добавьте раствор PEI в смесь для трансфекции, чтобы получить смешанный раствор. Немедленно сделайте вихрь (на максимальной скорости в течение 3-5 с, затем выполните то же самое) и раскрутите вниз.
- Выдерживать при комнатной температуре 15-30 мин. За это время смените среду ячеек HEK-293.
- Рассыпьте 500 мкл смешанного раствора по всей чашке с ячейками HEK-293 и инкубируйте в течение ночи (13-14 ч).
- Выполните средний обмен на следующий день.
3. Лизис клеток и пробоподготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание деградации белка последующие этапы должны выполняться без консервации или замораживания-размораживания образца, насколько это возможно.
- Примерно через 48 ч после трансфекции трижды промыть клетки ледяным PBS, добавить 500 мкл/чашку буфера для лизиса белка + PI, и собрать клетки скребком для клеток и пипеткой в пробирку с низкой адсорбцией белка на льду.
- Делайте вихрь каждые 5 минут и инкубируйте образцы на льду в течение 10 минут.
- Центрифуга при 16 400 x g в течение 10 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в свежую пробирку объемом 1,5 мл с низкой адсорбцией белка. Образцы можно хранить при температуре -80 °C.
- Определить концентрацию белка в образцах с помощью набора для измерения концентрации белка в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
- Отделите 200-1000 μг одинакового количества белка в каждом образце, затем добавьте буфер для лизиса белка + PI, чтобы довести общий объем до 500-1000 μл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются на льду.
4. Приготовление навозной жижи
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте суспензию из геля протеина G и геля сродства эпитопной метки 1:1 за день до или в день иммунопреципитации.
- Приготовление геля с протеином G
- С помощью наконечника с отрезанным концом хорошо перемешайте, а затем отделите гель Protein G (см. Таблицу материалов) так, чтобы получить 20 мкл гранул на образец.
- Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 с при 4 °C и поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл буфера для лизиса белка + PI в гель Protein G, приготовленный на шаге 4.1.2, и перемешайте, постукивая и переворачивая. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 с при 4 °C, поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторите шаг 4.1.3 трижды.
- Добавьте равный объем буфера для лизиса белка к гелю с протеином G, чтобы получить суспензию для геля с протеином G в соотношении 1:1. Гелевую суспензию протеина G можно хранить при температуре 4 °C в течение примерно 1 дня.
- Приготовление аффинного геля эпитопной метки
- С помощью наконечника с отрезанным концом хорошо перемешать, а затем отделить гель сродства эпитопной метки (см. Таблицу материалов) таким образом, чтобы получить 10-15 мкл гранул на образец.
- Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C и подождите 1 мин на льду, чтобы гранулы выровнялись. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл буфера для лизиса белка + PI в гель сродства эпитопной метки, приготовленный на шаге 4.2.2, и перемешайте, постукивая и переворачивая. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C, поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость пипеткой.
- Повторите шаг 4.2.3 дважды.
- Добавьте 500 μл 0,1 М глицина (pH 3,5) в аффинный гель эпитопной метки, приготовленный на шаге 4.2.4, и перемешайте, постукивая и переворачивая. Этот шаг выполняется для удаления свободных антител эпитопной метки. В течение 20 мин после добавления глицина центрифугировать при 5 000 х г в течение 30 с при 4 °С, поместить шарики на лед на 1 мин, чтобы гранулы выровнялись, и выбросить надосадочную жидкость.
- Добавьте 500 μл буфера для лизиса белка + PI в гель сродства эпитопной метки, приготовленный на шаге 4.2.5, и перемешайте, постукивая и инвертируя. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C, поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторите шаг 4.2.6 трижды.
- Добавьте равный объем буфера для лизиса белка к гелю сродства эпитопов, чтобы приготовить суспензию геля-сродства эпитопов 1:1. Гелевая суспензия epitope tag affinity может храниться при температуре 4 °C в течение примерно 1 дня.
5. Предварительное очищение гелем с протеином G и захват белковых комплексов с помощью геля с аффинностью эпитопной метки
- Смешайте суспензию с содержанием белка G 1:1 (приготовленную на шаге 4) с помощью пипетки с отрезанным наконечником и добавьте в образец по 40 μл.
- Вращайте образец в течение 1 ч на ротаторе (см. таблицу материалов) примерно за 30 с за цикл в холодильной камере (4 °C).
- Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 с при 4 °C и поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись.
- Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в новую пробирку объемом 1,5 мл с низкой адсорбцией белка.
- Отделите образец для ввода от образца на шаге 5.4 и перенесите его в новую пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте в образец 20-30 μл гелевой суспензии эпитопной метки 1:1.
- Вращаться на ротаторе в течение примерно 30 с за цикл в холодильной камере (4°С) в течение 2 ч.
- Добавьте буфер для образца на вход, приготовленный на шаге 5.5, чтобы разбавить его до 4x, и нагревайте при 98 °C в течение 10 минут. Вход может храниться при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за возможности деградации белка из-за замораживания и размораживания последующие шаги следует выполнять без максимального сохранения белка.
6. Промывка и элюирование осажденных белков
- Установите температуру теплоблока на 98 °C.
- Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C и подождите 1 мин на льду, чтобы гранулы выровнялись. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл буфера для лизиса белка + PI и перемешайте, постукивая и инвертируя. Вращайте вращатель в течение примерно 30 с за цикл в холодильной камере (4 °C) в течение 5 минут. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C, подождите 1 мин на льду, чтобы гранулы выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторите шаг 6.3 5-10 раз.
- Добавьте 10 мкл буфера для образца к образцу, подготовленному на шаге 6.4. Варить при температуре 98 °C 10 мин.
- Центрифуга при 5 000 x g при 4°C в течение 30 с.
- Поместите колонку в новую пробирку с низкой адсорбцией белка и перенесите гель в колонку с помощью пипетки с отрезанным наконечником. Во избежание загрязнения геля используется колонка.
- Центрифуга при 9 730 x g в течение 1 мин при 4 °C. Соберите протекание. Образец можно хранить при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть опасения по поводу деградации образца, следующий иммуноблоттинг следует проводить без замораживания.
7. Иммуноблоттинг
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры иммуноблоттинга основаны на предыдущих отчетах 7,8.
- Загрузите целые образцы на полиакриламидный гель додецилсульфата натрия (SDS-PAGE, см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте гели с большими лунками, чтобы можно было перенести весь образец. Здесь использовались гели с лунками объемом 50 мкл. - Поместите гели в камеру электрофореза и добавьте 1x буфер Tris/Glycine/SDS (см. Таблицу материалов) до соответствующего объема вокруг гелей.
- Электрофорезные гели при 100 В и 400 мА.
- Перенос на поливинилиденфторидные (PVDF, см . Таблицу материалов) мембраны.
- Блокируйте мембранные блотки PVDF 5% обезжиренным молоком в PBS-P на 1 ч при комнатной температуре.
- Трижды промыть мембрану PBS-P в шейкере на максимальной скорости в течение 5 минут. После этого выполните ту же процедуру при стирке.
- Инкубировать в течение ночи в шейкере с первичным антителом (см. Таблицу материалов) при 4 °C.
- На следующий день трижды промыть мембрану PBS-P.
- Инкубировать в течение 1 ч с вторичным антителом в шейкере при комнатной температуре.
Если молекулярная масса белка-мишени близка к тяжелой цепи IgG, которая имеет молекулярную массу около 50 кДа, можно использовать вторичное антитело, специфичное для легкой цепи, чтобы избежать перекрытия полосы-мишени с тяжелой цепью IgG. В этом исследовании в качестве реагента для обнаружения ВП использовались антитела, специфичные к легкой цепи7 или Veriblot (см. Таблицу материалов). - Идентификация полос белков с люминесцентными субстратами пероксидазы. Мембрану можно сохранить в PBS после двойной промывки PBS-P.
- Зачистите в течение 10 мин раствором для снятия изоляции (см. Таблицу материалов).
- Вымойте трижды и залейте 5% обезжиренным молоком в PBS-P. После этого протокол такой же, как и на шаге 7.6 и далее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Термогенные адипоциты, также известные как коричневые и бежевые адипоциты, обладают потенциальными эффектами против ожирения и непереносимости глюкозы. PR (PRD1-BF1-RIZ1 гомологичный) домен, содержащий 16 (PRDM16), является кофактором транскрипции, который играет важную роль в определении термогенной идентичности адипоцитов 9,10.
EHMT1 (эухроматическая гистон-лизин N-метилтрансфераза 1), также известная как GLP, в первую очередь катализирует моно- и диметилирование лизина 9 гистона H3 (H3K9) с использованием кофактора S-аденозилметионина 11. В предыдущем отчете указывалось, что EHMT1 является важной метилтрансферазой в комплексе PRDM16, которая контролирует термогенную судьбу жировых клеток посредством метилирования гистонов12,13. Более того, ранее мы сообщали, что уровни экспрессии PRDM16 и EHMT1 в значительной степени коррелируют с термогенными генами в оперипочечной бурой жировой ткани человека (BAT), что позволяет предположить, что как PRDM16, так и EHMT1 играют важную роль в развитии BAT человека8.
Чтобы продемонстрировать эффективность этого протокола в качестве метода подтверждения ИПП, мы трансфицировали DYKDDDDK-PRDM16 и HA-EHMT1 в клетки HEK-293 и иммунопреципитировали DYKDDDDK-PRDM16 с использованием вышеуказанного протокола. PRDM16, меченный DYKDDDDK, и EHMT1, меченный HA, были вставлены в сайты клонирования экспрессирующего вектора pcDNA3.1 млекопитающих (см. Таблицу материалов). Иммуноблоттинг подтвердил ассоциацию между DYKDDDDK-PRDM16 и HA-EHMT1 в группах, трансфицированных DYKDDDDK-PRDM16 и HA-EHMT1 (рис. 2).
Рисунок 1: Схематическое изображение ко-иммунопреципитации. Схема протокола показана здесь. В правой части показан рабочий процесс протокола; В левой части показано графическое представление реакций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: PRDM16 ассоциируется с EHMT1. Клетки HEK-293 трансфицировали вектором (отрицательный контроль), DYKDDDDK-PRDM16 или DYKDDDDK-PRDM16 и HA-EHMT1. Впоследствии ко-иммунопреципитацию проводили с использованием геля сродства DYKDDDDK с последующим иммуноблоттингом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Буфер для лизиса белка 250 мл (фильтрация 0,22 мкм, хранение при 4 °C) | ||
| мл | Конечная концентрация | |
| 1 м Трис pH 8,0 | 12.5 | 50 мМ |
| 5 млн NaCl | 7.5 | 150 мМ |
| 0,5 М этилендиаминтетрауксусная кислота | 0.5 | 1 мМ |
| Глицерин | 25 | 10% |
| Полиоксиэтилен(10) октилфениловый эфир | 2.5 | 1% |
| ДДВ | 202 | |
| Итог | 250 | |
Таблица 1: Состав буфера для лизиса белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол почти похож на ранее опубликованные протоколы 5,7,14,15. Важным моментом этого протокола является то, что мы никогда не останавливаем эксперимент от этапа лизиса клетки до этапа иммунопреципитации. Деградация белка препятствует выявлению ИПП. Удлиненный временной курс и повторяющиеся циклы замораживания-размораживания разрушают белки. Электрофорез в SDS-PAGE также следует проводить в день иммунопреципитации не только для минимизации деградации белка, но и для максимального обнаружения ИПП.
В термогенных адипоцитах взаимодействие между EHMT1 и PRDM16 было описано в предыдущем исследовании13. Комплекс EHMT1 - PRDM16 регулирует судьбу клеток бурых адипоцитов и термогенез13. EHMT1 заставляет PRDM16 стабилизироваться, прерывая взаимодействие PRDM16 - амилоидный белок-связывающий белок (APPBP) 216. Эта стабилизация PRDM16 регулируется cullin(CUL) 2-APPBP2 и EHMT116.
В этом исследовании использовались клетки HEK-293, потому что клетки HEK-293 широко используются в производстве рекомбинантных белков17. Можно использовать другие клеточные линии, которые легко трансфицировать плазмидами, такие как клетки Cos-7 и клетки Hela. ПЭИ был использован для трансфекции, потому что ПЭИ более экономичен и прост по сравнению с обычной липофекцией.
Предварительная очистка, вращение в геле сродства эпитопных меток и промывка являются особенно важными этапами в этом методе. Предварительное очищение может удалить белки, которые неспецифически связываются с гелем. Кроме того, важно время для вращения гелем аффинности эпитопной метки, поскольку чрезмерное время может привести к обнаружению неспецифических белков, а недостаточное время может затруднить обнаружение белков-мишеней.
Следует отметить следующие моменты. Ячейки HEK-293 легко отсоединяются; поэтому при подготовке образцов следует использовать посуду, покрытую коллагеном. Раствор ПЭИ цитотоксичен; Поэтому среду следует заменять после трансфекции, не покидая клетки на длительный период. Если ИПП не наблюдаются, количество трансфицированных плазмид может быть недостаточным и/или количество белка, поступающего в ИПП, может быть низким. Кроме того, если количество промывок чрезмерно, взаимодействия могут быть пропущены. Для решения этих проблем можно рассмотреть следующее: увеличение количества плазмиды, вводимой в клетки HEK-293, увеличение количества белка, используемого для IP, и уменьшение количества промывок. Кроме того, если в окончательной промывке останется слишком много надосадочной жидкости, она выльется из лунок додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия. Если наблюдаются неспецифические полосы, количество плазмиды/белка, используемого для IP, может быть слишком высоким, или количество или интенсивность смывов могут быть недостаточными. Эти проблемы могут быть решены путем уменьшения количества плазмиды/белка, используемого для IP, увеличения количества стирок или увеличения моющей способности за счет увеличения концентрации соли в буфере для стирки.
Широко используемые детергенты, такие как октилфениловый эфир полиоксиэтилена (10), могут нарушать функционально значимые ИПП18. Более мягкие детергенты могут увеличивать восстановление функционально важных комплексов, в то время как они могут давать неприемлемый уровень неспецифических взаимодействий из-за неполной солюбилизации. Буфер для лизиса белка, используемый в настоящем исследовании, содержит 1% полиоксиэтилена (10) октилфенилового эфира. Этот буфер лизирует цитоплазматические белки с большим количеством белков, сверхэкспрессируемых трансфицированными плазмидами. Когда иммунопреципитацию проводят на образцах, приготовленных путем разделения ядер и цитоплазмы, фон уменьшается по сравнению с образцами, полученными методом лизиса целых клеток, и можно идентифицировать четкие полосы-мишени17. Если иммунопреципитацию проводят с белками в ядре, ядерные белки можно экстрагировать с помощью коммерческого набора для ядерной экстракции или путем разрушения и удаления цитоплазмы с помощью детергента, содержащего детергент с низким содержанием солей, и последующей экстракции ядерных белков с высоким содержанием соли в буфере19. Время развития иммуноблоттинга должно быть скорректировано не только для того, чтобы избежать фона, но и для выявления определенных полос.
Этот метод имел несколько ограничений. Во-первых, мы использовали PPI, который, как ожидается, будет обнаружен. Во-вторых, поскольку экспрессия каждого гена зависит от комбинации плазмид, может быть получено недостаточное количество белка, и поэтому взаимодействие может быть не обнаружено.
Таким образом, используя этот метод, ИПП могут быть экономически и легко подтверждены по сравнению с масс-спектрометрией. ИПП между различными белками, слитыми с эпитопными метками, также может быть подтвержден путем использования аффинных антител против каждой метки вместо геля аффинности эпитопной метки. Аналогичные методы иммунопреципитации могут быть выполнены в других типах клеток путем введения плазмиды, экспрессирующей любой белок, слитый с меткой DYKDDDDK. Кроме того, использование эндогенных антител вместо геля аффинности эпитопной метки позволяет подтвердить эндогенные ИПП в различных типах клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы заявляем, что ни у одного из авторов нет конфликта интересов, связанного с этим исследованием.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) Грант KAKENHI No 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant No 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant No 22K08672 (H.O.), исследовательский грант Японского диабетического общества для молодых исследователей (G.N.) и исследовательский грант MSD Life Science Foundation для молодых исследователей (G.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
- Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
- Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
- Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
- Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
- Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
- Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
- Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
- Cristea, I. M., Chait, B. T.
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
- Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
- Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).
