Decellulariserende Mammary Fat Pads: Afleiden van Extracellulaire Matrix Hydrogels van Mammary Fat Pads

Overview

Deze video beschrijft een techniek om extracellulaire matrixhydrogels af te leiden door muriene melkzuurkussens te decellulariseren na ex vivo bestraling voor in vitro studies. Deze hydrogel helpt bij het nabootsen van de in vivo borstweefselomgeving na de bestraling om het gedrag van tumorcellen te bestuderen.

Protocol

1. Decellularisatie

OPMERKING: Deze procedure werd aangepast van eerder gepubliceerde methoden gericht op vetdecellularisatie, waaronder het natriumdeoxycholaat ionische wasmiddel in plaats van natriumdodecylsulfaat om DNA efficiënt te verwijderen.

1. Verwijder op dag 1bevroren Mammary Fat pads of MFPs van -80 °C en ontdooi bij kamertemperatuur.
2. Eenmaal ontdooid, droog mvp's kort op een delicate taak veeg. Weeg de MSP's af met behulp van een analytische weegschaal.
3. Verdeel met behulp van een tang met een schaar of een scalpel weefsel in monsters van 3 mm x 3 mm x 3 mm voor onderzoek van de intacte ECM en het resterende weefsel voor hydrogelproductie.
   OPMERKING: Het aantal monsters is afhankelijk van het aantal testmethoden, bijvoorbeeld de verzameling van twee monsters wordt hieronder beschreven: één voor paraffine-inbedding (stap 1.5) en één voor bevriezing in cryostaat-inbeddingsmedium, indien gewenst (zie de tabel met materialen en stap 1.6).
4. Weeg de tissues. Als u in paraffine insluit voor doorsneden, gaat u verder met stap 1.5. Als het invriezen in cryostaat inbeddingsmedium voor sectioning, ga dan verder met stap 1.6.
5. Dompel het weefsel in een chemische kap gedurende 24 uur bij 4 °C onder in 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) (zie de tabel met materialen). Was 3 keer in PBS gedurende elk 5 minuten. Dompel het weefsel gedurende 48 uur bij 4 °C onder in 30% sacharose.
   1. Weeg het weefsel nu dit stuk is verwijderd. Ga verder met stap 1.6.
6. Plaats in een chemische kap MFP-stukken in een gelabelde cassette die is voorbereid met een cryostaat-insluitmedium. Voeg meer cryostaat inbeddingsmedium toe om het weefsel te bedekken.
   1. Plaats de cassette in een bekerglas van 2-methylbutaan (zie de tabel met materialen)dat voorgekoeld is met vloeibare stikstof. Het bekerglas moet voldoende 2-methylbutaan hebben om de bodem te bedekken, maar niet genoeg om de cassette onder te dompelen, omdat het cryostaat-insluitmedium het 2-methylbutaan niet mag raken. Laat de cassette in het 2-methylbutaan zitten totdat het cryostaat inbeddingsmedium bevriest en ondoorzichtig wordt.
   2. Wikkel de cassette(s) in folie, etiket en laat bij -80 °C staan tot het wordt gebruikt voor het doorsnijden.
      OPMERKING: Weefsels die onmiddellijk in cryostaat-inbeddingsmedium werden geplaatst, werden gesectied op 5 μm, terwijl weefsels geïncubeerd in sucrose werden gesectied op 30 μm om adipocytmorfologie te behouden.
7. Gebruik een tang om het resterende weefsel handmatig te masseren.
   OPMERKING: Weefselstukken kunnen ook gedurende 24-48 uur in 10% NBF worden geplaatst, in PBS worden gespoeld en in 70% ethanol worden achtergelaten totdat ze in paraffine worden ingesloten. Na inbedding kunnen 5 μm secties worden gebruikt voor hematoxyline en eosine (H & E) kleuring (zie rubriek 2 hieronder).
8. Plaats de MMP's in gerechten van 6 cm met 5 ml 0,02% trypsine/0,05% EDTA-oplossing. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur. Spray en veeg de vaat af met 70% ethanol voordat je ze in de incubator plaatst.
9. Gebruik 0,7 mm zeefmachines om de MMP's met gedeioneerd (DI) water te wassen door driemaal water over het weefsel te gieten. Gebruik een tang om het weefsel tussen de wasbeurten door handmatig te masseren.
10. Droog kort weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Plaats tissues in een voorgeautoclaveerd bekerglas met een roerstaaf van de juiste grootte. Bedek weefsels met 60 ml 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (zie de tabel met materialen)per 1 g weefsel en roer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gebruik minimaal 20 ml.
11. Dump weefsel en inhoud in een zeef. Spoel het bekerglas af met DI-water en giet het op tissues. Herhaal dit nog twee keer. Gebruik de tang om het weefsel tussen de spoelingen door handmatig te masseren.
12. Droog kort weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Plaats tissues en roerrepen terug in dezelfde beakers en dek af met 60 ml 4% deoxycholzuur per 1 g weefsel. Roer gedurende 1 uur op kamertemperatuur. Gebruik minimaal 20 ml.
13. Dump weefsel en inhoud in een gaaszeef. Spoel het bekerglas af met DI-water en giet het op tissues. Herhaal dit nog twee keer. Gebruik de tang om het weefsel tussen de spoelingen door handmatig te masseren.
14. Droog kort weefsel op een delicate taak veeg en weeg.
15. Plaats weefsels in hetzelfde bekerglas met vers DI-water aangevuld met 1% penicilline-streptomycine. Bedek goed met paraffinefilm. Laat 's nachts bij 4 °C staan.
16. Was zeefjes en beakers voor gebruik de volgende dag.
17. Giet op dag 2de bekerinhoud af in een zeef. Droog kort weefsel op een delicate taak veeg en weeg.
18. Plaats MMP's in hetzelfde bekerglas met een roerstaaf van de juiste grootte. Dek af met 60 ml 4% ethanol/0,1% per azijnzuuroplossing per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 ml. Roer gedurende 2 uur op kamertemperatuur.
19. Dump weefsel en inhoud in een zeef van 0,7 mm. Gebruik een tang om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud terug in het bekerglas. Was weefsel door het te bedekken met 60 ml 1x PBS per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 ml. Roer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit één keer.
20. Dump weefsel en inhoud in een zeef van 0,7 mm. Gebruik een tang om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud terug in het bekerglas. Was weefsel door het te bedekken met 60 ml DI water per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 ml. Roer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit één keer.
21. Droog kort weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Dump weefsel en inhoud in een zeef. Gebruik een tang om het weefsel handmatig te masseren.
22. Plaats de inhoud terug in het bekerglas. Bedek weefsels met 60 ml 100% n-propanol per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 ml. Roer gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
23. Droog kort weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Dump weefsel en inhoud in een zeef van 0,7 mm. Gebruik een tang om het weefsel handmatig te masseren.
24. Plaats de inhoud terug in het bekerglas. Was weefsel door het te bedekken met 60 ml DI-water per 1 g weefsel. Gebruik minimaal 20 ml. Roer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit drie keer.
25. Dump weefsel en inhoud in een zeef. Herhaal stap 2.3–2.6 om stukjes weefsel te verzamelen voor sucrose incubatie en bevriezing in cryostaat inbeddingsmedium.
26. Droog kort weefsel op een delicate taak veeg en weeg. Plaats in een gelabelde buis van 15 ml. 's Nachts bevriezen bij -80 °C.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5