En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

Summary

Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.

Abstract

Antecedentes: Los factores de regulación y de la fisiología detallada de la microcirculación in vivo se han mantenido no totalmente aclarado después de muchos diferentes modalidades de imagen se había inventado. Si bien muchos parámetros macroscópicos del flujo sanguíneo refleja la velocidad de flujo, los cambios en la velocidad del flujo sanguíneo y de glóbulos rojos (RBC) de flujo no se mantiene una relación lineal en las observaciones microscópicas. Hay informes de discrepancia entre la velocidad y el flujo de RBC RBC, el flujo de glóbulos rojos y el volumen de plasma de flujo y de la heterogeneidad espacial y temporal de regulación de flujo en los tejidos periféricos, en las observaciones microscópicas, una base científica para la exigencia de estudios más detallados en la regulación de la microcirculación con microscopía intravital.

MÉTODOS: Se modificó el método de Jeff Lichtman en la observación microscópica in vivo de los músculos esternocleidomastoideo ratón. Los ratones son anestesiados, ventilados, y se inyecta con PKH26L-fluorescencia glóbulos rojos marcados para la observación microscópica.

RESULTADO Y CONCLUSIONES: Los glóbulos rojos marcadas fluorescentemente se detectan y se distingue también por un microscopio de campo amplio. La contracción muscular provocada por aumento de la estimulación eléctrica inducida en el flujo de RBC. La cuantificación de otros parámetros como la velocidad de glóbulos rojos y la densidad capilar eran factibles. Los ratones toleraron bien la cirugía, la inyección de glóbulos rojos manchados, la observación microscópica, y la estimulación eléctrica. No hay daños en músculos y los vasos sanguíneos se observó, lo que sugiere que nuestro método es relativamente menos invasivo y adecuado para observaciones a largo plazo.

Protocol

RBC tinción de membrana Ratón las células rojas de la sangre se han corregido de la misma cepa de ratón con heparinización. Ratón RBC fueron teñidas con tinte PKH26 (551/567 nm, rojo fluorescente kit enlazador celular, Sigma, EE.UU.). RBC se lavaron en PBS y se incubaron con una solución de 2μM PKH26 colorante durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de plasma (inactivado por calor durante 1 hora a 65 ° C antes) y se incubó durante 1 m…

Discussion

Importantes puntos TÉCNICAS son las siguientes: (1) mantenimiento del estado fisiológico del animal (ventilación, el pH de la solución de la temperatura corporal perfusative,), (2) el volumen de inyección de los glóbulos rojos manchados, y las condiciones (3) para la observación (óptima del lente selección, la intensidad de fluorescencia). Las posibles aplicaciones futuras son las siguientes: (a) junto con las intervenciones biológicas pharmacophysiological y / o molecular, (b) observación a largo plazo de la arterio / arteriolo …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PKH26 dye		Sigma		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.