In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Summary

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

Abstract

ACHTERGROND: Regulatory factoren en gedetailleerde fysiologie van in vivo microcirculatie zijn gebleven niet volledig duidelijk na vele verschillende modaliteiten van beeldvorming had uitgevonden. Terwijl veel macroscopische parameters van de bloedstroom reflecteren stroomsnelheid, veranderingen in de snelheid van de bloedstroom en rode bloedcellen (RBC) flux heeft lineaire relatie niet te houden in de microscopische waarnemingen. Er zijn meldingen van discrepantie tussen RBC snelheid en RBC flux, RBC flux en plasma flow volume, en van de ruimtelijke en temporele heterogeniteit van debietregeling in de perifere weefsels in microscopische waarnemingen, een wetenschappelijke basis voor de eis van meer gedetailleerde studies in microcirculatie regelgeving met behulp van intravitale microscopie.

METHODEN: We gewijzigd Jeff Lichtman de methode van in vivo microscopische observatie van de muis musculus sternocleidomastoideus spieren. Muizen zijn verdoofd, geventileerd, en geïnjecteerd met PKH26L-fluorescent gelabelde rode bloedcellen voor microscopisch observatie.

RESULTAAT & CONCLUSIES: fluorescent gelabelde RBC worden gedetecteerd en goed herkenbaar aan een wide-field microscoop. Spiercontractie opgewekt door elektrische stimulatie geïnduceerde toename van RBC flux. Kwantificering van andere parameters zoals RBC snelheid en de capillaire dichtheid waren haalbaar zijn. Muizen goed verdragen de operatie, injectie van gebrandschilderd RBC, microscopische observatie, en elektrische stimulatie. Geen spieren of bloedvaten zijn aangetast werd waargenomen, wat suggereert dat onze methode is relatief minder invasieve en geschikt voor lange-termijn observaties.

Protocol

RBC membraankleuring Muis rode bloedcellen werden gecorrigeerd uit dezelfde muizenstam met heparinization. Muis RBC werden gekleurd met PKH26 kleurstof (551/567 nm; Red fluorescent cel linker kit, Sigma, USA). RBC werden gewassen in PBS en geïncubeerd met 2μM oplossing van PKH26 kleurstof gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De reactie werd gestopt door het toevoegen van plasma (geïnactiveerd met warmte gedurende 1 uur bij 65 ° C op voorhand) en geïncubeerd gedurende 1 minuut. </l…

Discussion

Belangrijke techinical punten zijn als volgt: (1) onderhoud van de fysiologische status van het dier (ventilatie, pH van de perfusative oplossing, lichaamstemperatuur), (2) injectie volume van de gebrandschilderde RBC, en (3) de voorwaarden voor observatie (optimale lens selectie, fluorescentie-intensiteit). Mogelijke toekomstige toepassingen zijn als volgt: (a) combinatie met pharmacophysiological en / of moleculaire biologische interventies, (b) lange termijn observatie van de arterioveneuze / arteriolo-sclerose en neovascularisatie.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PKH26 dye		Sigma		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.