Bedömning av immunologiskt Relevanta Dynamic tertiär strukturella drag av HIV-1 V3 Loop Crown R2 sekvens av Ab initio Folding

Summary

Kronan regionen olika sekvenser V3 loopen av ytan kuvertet glykoprotein (gp120) av HIV-1 kan vara strukturellt präglas i många fall in silico vikning av positionerna 10 till 22 av slingan med en state-of-the-art

Abstract

Den antigen mångfald av HIV-1 har länge varit ett hinder för vaccin design, och denna variation är särskilt uttalad i V3 loopen av viruset "yta kuvertet glykoprotein. Vi föreslog tidigare att kronan i V3 loopen, men dynamisk och sekvens variabel är låst under hela befolkningen av HIV-1 virus till ett immunologiskt relevanta β-hårnål tertiär struktur. Viktigt, det finns tusentals olika krona V3 loopen sekvenser i cirkulerande HIV-1-virus, vilket gör 3D strukturbestämning av tendenserna i den mångfald av virus svårt eller omöjligt med kristallografi och NMR. Våra tidigare framgångsrika studier med infällning av V3 kronan ^{1, 2} använde från början algoritm ³ tillgängligt i ICM-Pro molekylmodellering programvarupaket (Molsoft LLC, La Jolla, CA) och föreslog att kronan i V3 loopen, särskilt från positionerna 10 till 22, fördelar sig tillräckligt från den flexibilitet och längden av dess flankerande härrör ska bete sig i hög grad som om det vore en obegränsad peptid fritt fällbara i lösning. Som sådan snabb från början vikning av just denna del av V3 loop på varje enskild stam av 60 tusen + cirkulerande HIV-1-stammar kan vara informativ. Här vek vi V3 loop av R2-stammen att få insikt i de strukturella grund av dess unika egenskaper. R2 bär en sällsynt sekvens V3 loop tros vara ansvarig för den utsökta känslig denna stam till neutralisering av patient sera och monoklonala antikroppar ^{4, 5.} Stammen förmedlar CD4-oberoende infektion och tycks framkalla brett neutraliserande antikroppar. Vi visar hur utvärderingen av resultaten av de fällbara kan vara informativ för att associera observerade strukturer i det fällbara med immunologiska aktiviteter noterats för R2.

Protocol

1. Metodik

1. Det första steget i protokollet är att välja V3 kronan sekvens du vill lägga dig i silico. För R2 stammen är ordningsnumret för den här fragment KSIPMGPGRAFYT.
2. 3D-atomära strukturen av peptiden motsvarar denna sekvens bör byggas i datorns virtuella rymden. ICM kommandot för detta är:
   buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
   eller Arkiv: Ny: kan Peptide väljas under rullgardinsmenyn
3. Flera parametrar av förfarandet ställ, inklusive antalet sökning steg (längden på sök), simuleringen temperatur, sökparametrar strategi, inklusive rörliga begränsningar för partiskhet sökningen till rimliga områden, det gäller energi, val av olika metoder energi beräkning, och parametrar som visar hur sökningen kommer att redovisas till exempel om att spela in en film och hur många mellanliggande scoring konformationer bör registreras. Alla dessa parametrar har optimerats av tidigare publikationer (se www.molsoft.com).
4. Den fällbara sedan inleds med kommandot:
   montecarlo
   eller Arkiv: Ny: Peptide kan väljas under rullgardinsmenyn Molecular Mechanics: Minimera: Global
   
   I det förra fallet bör de parametrar från steg 3 ställas in en efter en i kommandoraden. I det senare fallet är kryssrutor för de mest valda parametrar som anges i en ruta innan kommandot exekveras. För enkelhetens skull är det samma vikning ICM manus utnyttjas för detta experiment och tidigare publicerade experiment visas här:
   
   Detta skript kan sparas i en textfil och kör från datorns operativsystem kommandorad (oftast LINUX) snabbt med kommandot:
   ICM _foldingscript
   

2. Hemligheter till framgång

1. Den V3 loopen är en konstant 35 aminosyror i längd i nästan varje känd stam, så aminosyran positioner är numrerade från 1 till 35 från och med ursprung disulfide bundna cystin vid 1 och avslutas med motsvarande disulfide bundna cystin vid 35. Eftersom det är en del av en slinga, bör gränserna för kronan i V3 noga utvalda. Om alltför stor fragment väljs, är det osannolikt att bete sig som ett fritt flexibel segment som om det var en gratis peptid, så det fällbara simuleringen inte korrekt bedömning av strukturen. Om ett för litet fragment väljs kan den informativa tertiärstruktur ingår inte i simuleringen. Vår tidigare studie visade att fragmentet från position 10 till plats 22 korrelerade med antikropp bunden kristallografiska konformationer, så detta är fragmentet av V3 loop som bör väljas för hopfällbar.
2. Trots att använda det grafiska användargränssnittet och rullgardinsmenyer är användarvänlig, den tidigare framgångsrika arbetet med peptid fällbara i allmänhet med hjälp av ICM och V3 loop krona fällbara framförallt använt scriptet ovan, att helt enkelt ändra sekvensen i buildpep linje och kör ovanstående skript från kommandoraden rekommenderas.

3. Representativa resultat

Resultaten för R2-vikning är representativa för resultaten för alla V3 loop. Att utvärdera resultaten bör projektet filen (den kommer att heta "newProject1.icb" från ovanstående manus) öppnas och "molekylär mekanik, Stack, Visa" valts. En tabell i bunten konformationer visas. Stacken konformationer kan visualiseras grafiskt genom att klicka på Plot / histogram ikonen. "Molecular Mechanics, skorsten, Play" kommer att göra en film i stacken för att visuellt uppskatta konformationsanalys preferenser avslöjats av vikning. För R2 sekvensen är konformation beta-hårnål-liknande som väntat för V3 slingor ² - särskilt i fragment i position 12 till 14, där en tydlig β-strängen föredrar ses hela bunten, och mycket få alfa-spiralformade konformationer ses. Dessutom är en energi gap på nästan 3 enheter ses mellan de lägsta energi konformation och den näst lägsta energi konformation. Ur en energisk synvinkel innebär detta att den struktur bara flimrar av den lägsta energin konformation mindre än en procent av tiden: de fällbara resultaten därför föreslå att R2-V3 kronan är en styv, snarare än flexibel struktur. Det kan finnas ytterligare viktiga strukturella drag i ensemble konformationer, men de är svåra att systematiskt uppskatta.

	JRFL	SF162_V3JRFL	SF162_V3R2
447-52D GMT 50	15	0,00061	0,00078

Tabell 1: Relativ neutralisering av JRFL och R2 V3 loopar i maskerade och omaskerade inställningar. Uppgifterna har tidigare rapporterats i Cardozo T., et al. ARHR (2008) och Pinter, A., et. al J. Virol (2004). Kortfattat var neutraliserande aktivitet bestäms med en enda cykel smittsamhet analysen med psVs genererats med env-defekta luciferas-uttrycker pNL4-3.Luc.RE-plasmid pseudotyped med JRFL ENV-eller SF162 varianter V3 som beskrivs ovan: SF162_V3JRFL innehåller JRFL V3 loop sekvens i stället för SF162 V3 loopen sekvens. SF162_V3R2 innehåller R2 sekvens V3 loopen i stället för SF162 V3 loopen sekvens. Den psVs inkuberades med seriella spädningar av den 447-52D mAb för 1,5 h vid 37 ° C, och läggs sedan till CD4 + CCR5 + U87 målceller pläterade i 96-brunnar i närvaro av polybrene (10 mg = ml). Efter 24 timmar var cellerna refed med RPMI medium som innehåller 10% FBS och 10 mg = ml polybrene, följt av ytterligare 24-48 h inkubation. Luciferas aktivitet avgjordes 48-72 tim postinfection med en mikrotiterplatta luminometer (HARTA, Inc.) med analysreagenser från Promega, Inc. Geometriskt medelvärde titrar för 50% neutralisering (GMT50) med 447-52D var bestäms genom interpolering från neutralisering kurvor och är medelvärden av minst tre oberoende analyser.

Discussion

Ab initio fällbara avslöjar högre strukturella egenskaper, vars effekter inte får framgå att studera enskilda aminosyror sekventiellt. Flera tidigare obskyra strukturella egenskaper R2 V3 loopen krona avslöjas av fällbara simulering. Dessa observerade strukturella preferenser kan korrelerar med observerade funktionella egenskaper R2 stam, nämligen känslighet för neutralisering och hyperinfectivity ^5.

För det första är ett tydligt β-strand tendens i N-terminal hälften av R2 V3 kronan på positionerna 12-14 observerats. Detta är platsen för R2 stammen ovanliga isoleucin-prolin-metionin (IPM) sekvens. Från kristallografiska strukturer 447-52D, 2219, Be48, 2557, 2558 och 537-D-anti-V3 antikroppar slinga bunden till V3 loop peptider, positionerna 12 till 14 i V3 loopen är bundna av dessa antikroppar, och när bunden, segmentet antar en lokal β-strand konformation. Den fällbara simulering föreslår således att R2-V3 loopen krona föredrar en konformation vid positionerna 12 till 14 som är ett komplement till kända anti-V3 loop neutraliserande antikroppar. Denna inställning kan förklara den observerade känslighet för neutralisering av denna stam.

För det andra visar simuleringen en lucka på tre energienheter mellan den lägsta energin konformation och näst lägsta energi konformation, vilket tyder på en fast struktur. HIV-1 är gp120 är en mycket dynamisk molekyl, som kräver en stor konformationsanalys skifte från sitt obundna, immunologiskt skydd (unliganded) form till dess mänskliga bunden receptorn och immunologiskt exponerade (liganded) form. Flexibilitet i V3 loopen kan krävas för att åstadkomma detta samarbete övergången, och den stela R2 V3 loop struktur observerade här kan motstå att flytta ut ur liganded form, mycket som en styv blocket kan vara svårare att stoppa undan i ett litet utrymme i jämförelse med en mjukare flexibel block. Detta motstånd att anta unliganded formen kan utsätta V3 loop, CD4 bindningsstället och CD4-inducerad neutralisering epitoper, som alla är karaktäristiskt exponerad i liganded form av gp120. Således kan den observerade styvhet också begreppsmässigt kopplas till de observerade neutralisering känslighet R2 påfrestningar.

Eftersom co-receptor interagerande form av V3 loopen kommer förmodligen också att bli en β-hårnål som utgör måltavla för neutraliserande antikroppar, tyder resultaten på att R2-V3 kronan är låst till co-receptor och neutraliserande antikroppar kompletterande form, vilket i sin tur kan främja hela gp120 till sin liganded form, vilket gör belastningen hög smittsamhet. Således både den observerade konformationsanalys preferenser och styvhet kan också begreppsmässigt förknippas med R2: s hyperinfectivity.

Detta arrangemang av en stel, men utsätts co-receptorn och antikroppar kompletterande konformation i V3 loopen skiljer sig från en flexibel, men begravd eller maskerade V3 slinga som är typiskt för HIV-stammar. Folding av JRFL stam (som uppvisar den konsensus subtyp B HIV-1-sekvens V3 slinga) visar också en β-strand preferenser, men många nära distribueras lägsta konformationer energi som tyder på V3 krona flexibilitet (data visas inte). Förutsägelsen skulle vara att denna V3 loopen sekvensen skulle vara mycket känslig för neutralisering av en lämplig antikropp som 447-52D om det utsattes istället för begravd. Som förväntat JRFL och R2 sekvenser är lika känsliga när de presenteras i en utsatt miljö inom en chimär SF162 pseudovirus där V3 loopen ersätts med JRFL eller R2 V3 loopar (tabell 1), men samma JRFL V3 loop är helt okänslig till neutralisering när de presenteras i dess ursprungliga JRFL sammanhang.

Dessa resultat tyder på att den ovanliga IPM sekvensen av R2-stam ger en styv, antikropp-bindande-site-kompatibel, co-receptor-bindande plats kompatibel form i centrala kronan region i V3 loopen. Den styvhet är en hypotes att hindra konformationsändringar flexibilitet gp120 som övergångar mellan liganded och unliganded former, låsa den i hög grad till sin liganded formulär där antikroppen optimala, co-receptor-optimala formen i V3 kronan är utsatt och tillgänglig. Resultatet är känslighet för neutralisering och hyperinfectivity av R2 påfrestningar. På detta sätt är ab initio fällbara experiment som beskrivs i detta protokoll informativ för hiv-vaccin forskning: fällbara resultat noterats för R2 här kan vara viktig för HIV-1 vaccin immunogen design som en ledtråd för hur man låser gp120-baserad immunogens in önskad , neutralisering känsliga konformationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICM-Pro	Molsoft LLC