Введение. stephensi Эмбрионы для генерации устойчивых к малярии комаров
Summary
Anopheles stephensi комары являются переносчиками малярии населяющие Индию и по всей Азии. Это видео демонстрирует технику для выполнения микроинъекций этого вида с трансгенов которые придают устойчивость к малярии комаров. Большая часть методологии продемонстрировали в этом видео применима к микроинъекции методов других видов комаров.
Abstract
Введение экзогенных генов в геноме комаров требует микроинъекции методов с учетом конкретных видов, представляющих интерес. Это видео демонстрирует протокол метод, используемый Джеймсом лаборатории microinject конструкций ДНК в эмбрионы Anopheles stephensi для генерации трансформированных комаров. Методы подготовки микроинъекции иглы, сбора и подготовки эмбрионов и выполнения микроинъекции проиллюстрированы.
Protocol
Подготовка заранее микроинъекции: Кровь комаров кормить: для инъекций с понедельника по среду кормить самок на предыдущую пятницу. Чтобы придать четверг и пятницу, кормить самок на понедельник на той же неделе. Подготовка Кварцевые иглы с помощью программы 2 и изотони…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection Quartz needles | Sutter Instrument | O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller. | ||
| Quartz puller | Tool | Sutter Instrument Co | P-2000 | Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| EndoFree plasmid kit | Quiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | for DNA cleaning | ||
| Construct DNA | 0.5 mg/ml | |||
| Helper plasmid | 0.3 mg/ml | |||
| Injection solution | Buffer | 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Isotonic buffer | see recipe in the protocol section | |||
| Dessication oil | Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection. | |||
| Blood | to feed mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, male and female. | ||
| Drosophila culture vial | for egg laying | |||
| Petri dishes | with isotonic buffer, for embryo hatching | |||
| Fine paintbrush | Sable # 0000 | |||
| 3MM Whatman paper | ||||
| Forceps #5 | ||||
| double sided tape | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica | with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification |
Citer Cet Article
Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e216, doi:10.3791/216 (2007).