Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos
Summary
Este artigo descreve métodos diferentes de crescimento<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilmes em cultura de células epiteliais das vias aéreas humanas. Estes protocolos podem ser adaptados para estudar diferentes aspectos da formação de biofilme, incluindo a visualização do biofilme, a coloração do biofilme, medindo a unidades formadoras de colônias (CFU) do biofilme e estudar a citotoxicidade biofilme.
Abstract
Biofilme bacteriano têm sido associados com um número de diferentes doenças humanas, mas o desenvolvimento de biofilme geralmente tem sido estudada em superfícies não-vivos. Neste artigo, descrevemos os protocolos para formar biofilmes de Pseudomonas aeruginosa nas células epiteliais das vias aéreas humanas (células CFBE) cultivadas em cultura. No primeiro método (chamado de modelo de biofilme estática Co-cultura), P. aeruginosa é incubada com células CFBE crescido como monocamadas confluentes em placas de cultura de tecido normal. Embora a bactéria é muito tóxico para as células epiteliais, a adição de atrasos arginina a destruição da monocamada tempo suficiente para formar biofilmes sobre as células CFBE. O segundo método (chamado de fluxo de células Modelo Biofilm Co-cultura), envolve a adaptação de um aparelho celular biofilme fluxo, que é frequentemente usado em biofilme de pesquisa, para acomodar uma lamela de vidro apoiar uma monocamada confluente de células CFBE. Este monocamada é inoculado com P. aeruginosa e uma bomba peristáltica, então, flui meio fresco através das células. Em ambos os sistemas, biofilme bacteriano forma dentro de 6-8 horas após a inoculação. Visualização do biofilme é reforçada pelo uso de P. cepas aeruginosa constitutivamente expressando a proteína verde fluorescente (GFP). A estática e fluxo de células ensaios Co-cultura de biofilme são sistemas modelo para P. início aeruginosa infecção do pulmão da fibrose cística (CF), e estas técnicas permitem diferentes aspectos da P. formação de biofilme e virulência aeruginosa a ser estudado, incluindo a citotoxicidade biofilme, a medição do biofilme UFC, e de coloração e visualização do biofilme.
Protocol
Discussion
Biofilmes são comunidades de bactérias que se formam em resposta a estímulos ambientais. Estes sinais ambientais globais levar a mudanças regulatórias dentro de cada bactéria, resultando na ligação a uma superfície, de agregação, a produção de exopolissacarídeos, e outros fenótipos, tais como aumento da resistência aos antibióticos 10. Ao longo das duas últimas décadas, muitas provas apoiou a hipótese de que biofilmes desempenham um grande papel na patogênese das infecções crônicas. Po…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a G. O Toole para orientação e sugestões no desenvolvimento destes modelos. Este trabalho foi financiado pela Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 ao GGA, STANTO07RO e STANTO08GA a BAS), os Institutos Nacionais de Saúde (T32A107363 para GGA e R01-HL074175 a BAS) e do Centro Nacional de Centros de Pesquisa de Recursos para a Excelência Investigação Biomédica (COBRE P20-RR018787 a BAS).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
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