شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان
Summary
هذه الورقة توضح أساليب مختلفة من النمو<em> الزائفة الزنجارية</em> الأغشية الحيوية على الخلايا المستنبتة الهوائية الظهارية البشرية. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات لدراسة الجوانب المختلفة لتشكيل بيوفيلم ، بما في ذلك التصور للبيوفيلم ، وتلطيخ لبيوفيلم ، وقياس مستعمرة (CFU) من بيوفيلم ، ودراسة السمسة بيوفيلم.
Abstract
وقد ارتبطت الأغشية الحيوية البكتيرية مع عدد من الأمراض التي تصيب الإنسان المختلفة ، ولكن عموما كانت التنمية بيوفيلم درس على الأسطح غير الحية. في هذه الورقة ، ونحن تصف بروتوكولات لتشكيل الأغشية الزائفة الزنجارية على الخلايا الظهارية البشرية الهوائية (خلايا CFBE) نمت في الثقافة. في الأسلوب الأول (يطلق عليه نموذج ثابت بيوفيلم المشارك الثقافة) ، P. وحضنت الزنجارية مع الخلايا كما نمت CFBE monolayers متكدسة على مستوى لوحات زراعة الأنسجة. على الرغم من أن البكتيريا السامة جدا على الخلايا الظهارية ، وبالإضافة إلى ذلك التأخير أرجينين تدمير المونولاير طويلة بما يكفي لتشكيل الأغشية الحيوية على الخلايا CFBE. الأسلوب الثاني (وهو ما يسمى التدفق الخلوي بيوفيلم النموذجي المشارك الثقافة) ، ويشمل التكيف من خلية جهاز بيوفيلم التدفق ، والتي كثيرا ما تستخدم في البحوث بيوفيلم ، ساترة لاستيعاب الزجاج دعم أحادي الطبقة من الخلايا CFBE متموجة. هذا هو تحصين المونولاير مع P. الزنجارية ومضخة تمعجية تدفقات ثم متوسطة جديدة عبر الخلايا. في كلا النظامين ، الأغشية الحيوية البكتيرية شكل داخل 6-8 ساعات بعد الحقن. ومما يعزز التصور للبيوفيلم عن طريق استخدام P. سلالات الزنجارية constitutively معربا عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP). وتدفق ثابت الخلية المقايسات بيوفيلم المشارك الثقافة هي نظم في وقت مبكر نموذجا للP. العدوى الزنجارية في الرئة الكيسي (CF) التليف ، وتسمح هذه التقنيات مختلف جوانب P. أن يكون درس الزنجارية تشكيل بيوفيلم والفوعة ، بما في ذلك السمسة بيوفيلم ، وقياس CFU بيوفيلم ، وتلطيخ والرؤية وبيوفيلم.
Protocol
Discussion
الأغشية الحيوية هي مجتمعات من البكتيريا التي تشكل استجابة للمؤثرات البيئية. هذه الاشارات البيئية تؤدي إلى تغييرات تنظيمية عالمية ضمن كل بكتيريا ، مما أدى إلى الربط إلى السطح ، والتجميع ، وإنتاج exopolysaccharides ، والظواهر الأخرى مثل زيادة مقاومة المضادات الحيوية 10. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر G. O تول عن التوجيه والاقتراحات في تطوير هذه النماذج. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة التليف الكيسي (ANDERS06F0 لGGA ، وSTANTO07RO STANTO08GA لوبا) ، والمعاهد الوطنية للصحة (T32A107363 لGGA وR01 – HL074175 لوبا) ، والمركز الوطني لبحوث الموارد مراكز البحوث الطبية الحيوية للتميز (كوبر P20 – RR018787 لوبا).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
