Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche
Summary
In questo video, Nijole Jasinskiene dimostra la metodologia utilizzata per generare transgenici zanzare Aedes aegypti, che sono vettori per la febbre dengue. Le tecniche per la corretta preparazione di aghi microiniezione, disidratanti embrioni, e l'esecuzione di microiniezione sono dimostrati.
Abstract
In questo video, Nijole Jasinskiene dimostra la metodologia utilizzata per generare transgenici zanzare Aedes aegypti, che sono vettori per la febbre dengue. Le tecniche per la corretta preparazione di aghi microiniezione, disidratanti embrioni, e l'esecuzione di microiniezione sono dimostrati.
Protocol
Preparazione in anticipo di microiniezione Zanzare alimentazione del sangue: per iniezione da Lunedi a Venerdì femmine alimentare sul precedente Giovedi. Preparare gli aghi di vetro utilizzando il programma di 3 o 2 (vedi Materiali). Posa tubo per gli embrioni è fiala cultura Drosophila. Cotone idrofilo bagnato in fondo, con un disco di carta da filtro umida che lo ricopre. Preparare antiscivolo in plastica di copertura da attaccare a doppio lato del nastro ad una estremità. T…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x Injection solution | Buffer | 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Construct plasmid | DNA | 0.5 mg/ml. | ||
| Helper plasmid | DNA | 0.3 mg/ml | ||
| EndoFree Plasmid kit | Kit | Qiagen | ||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | To clean DNA. | ||
| Glass puller | Instrument | Sutter Instrument Co | Model P-87 | Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100. Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50 |
| Quartz puller | Instrument | Sutter Instrument Co | Model P-2000 | Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Injection glass needles | Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument). | |||
| Aedes aegypti | Animal | Male and female mosquitos, to obtain embryos. | ||
| Drosophila culture vial | For mosquito egg-laying. | |||
| Halocarbon oil | Reagent | Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1) | ||
| Forceps No5 | Tool | |||
| Fine paintbrush | Sable | No. 0000 | ||
| Whatman paper | Tool | |||
| Microloader | Tool | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Transjector | Tool | Eppendorf | ||
| Microscope | Leica | With moving stage and micromanipulator. | ||
| 3MM Whatman paper | ||||
| double sided tape |
Citer Cet Article
Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e219, doi:10.3791/219 (2007).