A Procedure voor het bestuderen van de Footshock-Induced Herstel van cocaïne Seeking in laboratoriumratten

Summary

Diermodellen van terugval, bekend als herstel procedures, zijn uitgebreid gebruikt om de rol van stress studie terugval naar drugs zoeken. Hier doen we verslag van een methode voor het induceren van het herstel van cocaïne die in het laboratorium ratten via acute blootstelling aan milde, intermitterende elektrische footshock.

Abstract

De meest verraderlijke aspect van drugsverslaving is de hoge neiging tot terugval. Diermodellen van terugval, bekend als herstel procedures, zijn uitgebreid gebruikt om de neurobiologie en de fenomenologie van terugval naar druggebruik te bestuderen. Hoewel de procedurele varianten hebben zich in de afgelopen decennia, zijn de meest conventionele herstel procedures op basis van de drug zelf-administratie (SA) model. In dit model wordt een dier getraind om een ​​operante respons op geneesmiddelen te verkrijgen uit te voeren. Vervolgens wordt het gedrag vervalt door inhouding respons-contingente bekrachtiging. Herstel van drug zoeken wordt dan veroorzaakt door een discrete gebeurtenis, zoals een injectie van de opleiding drug, hernieuwde blootstelling aan drugs-geassocieerde cues, of blootstelling aan een stressor ^1.

Herplaatsing procedures werden oorspronkelijk ontwikkeld om het vermogen van acute niet-contingent blootstelling aan de opleiding geneesmiddel medicijn zoeken bij ratten en apen ^{1, 2} opnieuw te bestuderen. Herplaatsing procedures zijn inmiddels aangepast aan de rol van milieu-stimuli, waaronder drugs-geassocieerde cues en de blootstelling aan diverse vormen van stress studie, terugval naar drugs op zoek naar ^{1, 3, 4.}

In de afgelopen 15 jaar, heeft een belangrijke focus van de herinvoering literatuur is over de rol van stress in drugs terugval. Een van de meest gebruikte vormen van stress voor het bestuderen van deze relatie is een acute blootstelling aan milde, intermitterende, elektrische footshocks. Het vermogen van footshock stress om herstel van de drug op zoek te induceren werd oorspronkelijk aangetoond door Shaham en collega's (1995) bij ratten met een geschiedenis van intraveneus heroïne SA ^5. Vervolgens was het effect gegeneraliseerd naar ratten met een geschiedenis van intraveneus cocaïne, metamfetamine, en nicotine SA, evenals oraal ethanol SA ^{3, 6.}

Hoewel footshock-geïnduceerde herstel van de drug op zoek naar betrouwbaar en robuust worden bereikt, het is een effect dat meestal gevoelig voor bepaalde parametrische variabelen. Deze omvatten de opstelling van uitsterven en herstel testsessies, de intensiteit en de duur van de footshock stress, en de aanwezigheid van drugs-geassocieerde cues bij het uitsterven en het testen voor herstel. Hier presenteren wij een protocol voor footshock-geïnduceerde herstel van cocaïne op zoek naar die we hebben gebruikt met consistente succes aan de relatie tussen stress en cocaïne op zoek te bestuderen.

Protocol

1. Stallen en acclimatisatie Procedures

1. Man Long Evans ratten met een gewicht van 300-325 g op het moment van aankomst in het vivarium, worden individueel gehuisvest in kooien met standaard plastic gerecycled papier pellet strooisel, draadrooster deksels om flessen water en voedsel tegemoet te komen.
2. Ratten worden onderhouden op een omgekeerde licht-donker schema (lampjes op 19:00 tot 07:00 uur), in een temperatuur-en vochtigheid-gecontroleerde vivarium.
3. Voedsel en water zijn beschikbaar ad libitum in de woning kooien gedurende het experiment.
4. Ratten mogen wennen aan het terrarium en de huisvesting voor een week voorafgaand aan de operatie. Gedurende deze tijd ratten worden ongemoeid gelaten, met uitzondering van routine reiniging, voeding, en controle van het gewicht.

2. Intraveneuze catheterisatie Chirurgie

1. Onder isofluraan anesthesie gas, en met behulp van standaard aseptische chirurgische technieken, zijn ratten bereid met silastic katheters in de rechter halsader. De katheter uitgangen in een aangepaste canule (Plastics One) aan het oppervlak van de schedel, en de canule wordt bevestigd aan de schedel met juweliers 'schroeven en tandheelkundig cement. Voor meer informatie over de chirurgische procedures, zie ^{7, 8.}
2. Aan het einde van de operatie, worden katheters gespoeld met ongeveer 0,2 ml van een oplossing met 50% heparine (1000 IE) en 50% dextrose (25 g/50 ml). Een plastic blocker is geplaatst over de opening van de canule om de katheter te beschermen tegen externe puin, en het katheter doorgankelijkheid te behouden.
3. Op het moment van de operatie, en opnieuw op de dag na de operatie, zijn ratten toegediend 5 mg / kg, SC, van de pijnstillende Ketoprofen.
4. Ratten zijn toegestaan ​​ten minste zeven dagen om te herstellen van een operatie voor de experimenten. Gedurende deze tijd, zijn ratten ongemoeid gelaten in het huis kooien, met uitzondering van routine-reiniging en voeding, en dagelijkse controle van het gewicht en de algemene gezondheid. Op de laatste dag van de herstelperiode, worden katheters gespoeld met de heparine / dextrose-oplossing (paragraaf 2.2) om katheter doorgankelijkheid te controleren.

3. Behavioral Procedures

Alle gedrag procedures worden uitgevoerd met apparatuur geleverd door Med Associates Inc (St Albans, VT). De uitrusting, ondergebracht in een speciale kamer, inclusief een set van standaard operant kamers, elk binnen een geluid-verzachtende behuizing. Elke operante kamer is uitgerust met twee uitschuifbare hendels, zowel verhoogde 6,5 cm boven een roestvrij stalen staaf vloer. Een witte stimulus licht ligt net boven een hendel, en reacties op die hendel (de zogenaamde "actieve" hendel) resulteert in de gelijktijdige verlichting van de stimulus licht en activering van een infusiepomp (Razel Scientific Instruments, St. Albans, VT). De pomp is gelegen op een plaats net buiten de operante kamer, maar binnen de geluid-verzachtende behuizing. De andere hendel (de zogenaamde "inactief" hefboom) van links uitgebreid in de kamer door alle experimentele procedures, het reageren op deze hefboom is zonder gevolgen. Tot slot is elke kamer uitgerust met constante stroom, intermitterend, onontkoombaar, elektrische footshock te leveren door middel van een Scrambler om de stalen staaf vloer. Alle experimentele condities (bijvoorbeeld stimulus presentaties, drugs infusies, shock levering), alsmede gegevens opnemen en consolidatie, worden bereikt via interfaces tussen de test kamers en een centrale computer besturingssysteem Med Associates software (MED-IV).

Het experiment wordt uitgevoerd in vijf fasen: 1) Gewenning, 2) Cocaïne SA, 3) drugsvrije periode; 4) Uitsterven, en 5) Testen op herstel. In alle fasen (behalve voor de drug-vrije periode), zijn ratten overgebracht voor de dagelijkse sessies van de behuizing ruimte aan de operante testkamers. Dieren worden individueel overgedragen, in kleine plastic containers. Voedsel en water zijn niet beschikbaar in de operante kamers.

1. Gewenning
   1. Vierentwintig uur voorafgaand aan de eerste sessie cocaïne SA (. Zie paragraaf 3.2), zijn ratten mogen wennen aan de operante kamers tijdens een twee-uur-sessie, tijdens deze sessie de actieve hefboom is ingetrokken.
2. Cocaïne SA training
   1. Voor elke dag training, zijn ratten gewogen in de behuizing ruimte. Daarna worden ze overgebracht naar de operante kamers.
   2. Bij plaatsing in de operante kamers, een veer en slangen assemblage (dat zich uitstrekt van de drug infusiepomp) is verbonden met de schedel gemonteerd canule.
   3. Ratten mogen cocaine HCl zelf toedienen tijdens de dagelijkse drie-h sessies, voor een totaal van 8-10 dagen (hetzij achtereenvolgens of met twee tussenliggende "dag off" tussen de sessies 5 en 6).
   4. SA sessies afwisselend de ochtend (09u00-12u00) en 's middags (13:00-16:00). De timing van de SA-sessies wordt afgewisseld omdat de procedures in de volgende fasen van het experiment (dat wil zeggen uitsterven en testen) vinden zowel plaats op tIMES van de dag voor alle dieren (zie paragrafen 3.4 en 3.5), en bijgevolg deze regeling voorkomt verstorende effecten van de tijd van de dag op latere drugs-zoekende gedrag.
   5. Elke training wordt voorafgegaan door een 5-min acclimatisatie periode, gedurende welke de dieren zijn geplaatst in de operante kamers met de actieve hendel ingetrokken.
   6. Aan het begin van de training, is de actieve hefboom uitgebreid naar de kamer en de stimulans licht (gelegen boven de actieve hefboom) is verlicht voor 30 s. Bovendien is het huis licht geactiveerd op dit moment, en blijft branden tijdens de sessie. Samen vormen deze gebeurtenissen het signaal van de beschikbaarheid van cocaïne.
   7. Tijdens de sessie, worden de antwoorden op de actieve hefboom versterkt door een 3-s infusie van cocaïne (0,23 mg/65 pi, iv) op een vaste verhouding-een schema van de wapening. Gelijktijdig met de activering van de infusiepomp en drug delivery is een 20-s activering van het stimulus licht boven de actieve hendel. Deze 20-s licht presentatie komt overeen met een 'time-out "periode waarin extra actieve hefboom antwoorden zijn opgenomen maar niet versterkt.
   8. Huisdieren zijn toegestaan ​​een maximum van 50 infusies per 3-h sessie. We regelmatig op te leggen aan dit criterium in ons werk en in onze ervaring, hebben ontdekt dat het sterk vermindert, zo niet elimineert, incidenten van de sterfgevallen als gevolg van een overdosis.
   9. Aan het einde van elke dagelijkse sessie, zijn ratten katheters gespoeld met 0,2-0,3 ml heparine-dextrose-oplossing (zie paragraaf 2.2) en de ratten zijn terug naar hun kooi.
3. Drug-vrije periode
   1. Na de laatste cocaïne SA-sessie, zijn ratten ongemoeid gelaten (met uitzondering van de routinematige reiniging, voeding, en controle van het gewicht) in hun kooi voor een minimum van zeven dagen.
4. Uitsterven van cocaïne opgeleide gedrag
   1. Ratten worden overgebracht naar de operante kamers tussen 09:00-10:00 voor uitsterven training.
   2. De lente en de slangen assemblage is verbonden met de schedel gemonteerd canule.
   3. In overeenstemming met de voorwaarden voor SA training, is iedere dag van uitsterven training voorafgegaan door een 5-min acclimatisatie periode, gedurende welke de dieren zijn geplaatst in de operante kamers met de actieve hendel ingetrokken.
   4. Ratten krijgen dan vier 60-min uitsterven sessies, gescheiden door 30-min intervallen. Elke 60-min-sessie is een initiatief van dezelfde gebeurtenissen die zich voordoen bij het begin van trainingen (dat wil zeggen, verlichting van het huis licht, de uitbreiding van de actieve hefboom, en de 30-sec verlichting van de stimulus licht boven de actieve hefboom). Gedurende de sessies worden aan alle voorwaarden die aanwezig waren tijdens de SA training gehandhaafd (dwz, respons-contingente verlichting van de stimulus licht voor 20 seconden en 3-s activering van de infuuspomp), behalve dat actief hefboom reacties worden niet langer versterkt met cocaïne infusies . Tijdens de 30-min interval dat elke 60-min uitsterven sessie scheiden, is de actieve hefboom teruggetrokken en het huis licht is gedoofd.
   5. Aan het einde van de laatste 60-min-sessie, zijn ratten terug naar hun kooi.
   6. Stappen 3.4.1. naar 3.4.5. worden herhaald gedurende 3 opeenvolgende dagen.
5. Herstel van cocaïne opgeleide gedrag van footshock spanning
   1. Ratten worden overgebracht naar de operante kamers tussen 09:00-10:00
   2. Bij plaatsing in de operante kamers, is de lente en slangen assemblage verbonden met de schedel gemonteerd canule.
   3. In overeenstemming met de voorwaarden voor de training en uitsterven, is een 5-min acclimatiseren termijn, waarin ratten worden geplaatst in de operante kamers met de actieve hendel ingetrokken.
   4. Ratten krijgen dan twee 60-min uitsterven sessies (zie 3.4.4.), Gescheiden door een 30-min interval, identiek aan die gegeven tijdens het uitsterven fase.
   5. Als na de tweede 60-min-sessie het totale aantal reacties op het vorige actieve hefboom is minder dan 15, zijn dieren die een test voor herstel na een extra 30-min interval. In deze 30-minuten interval, is footshock of sham footshock (dwz geen footshock) toegediend (zie 3.5.6.). Wanneer een criterium van 15 of minder antwoorden op het actieve hendel niet wordt bereikt na de tweede sessie, is een extra uitsterven sessie (s) voorafgaand aan het testen van herstel.
   6. Tien minuten na de tweede 60-min uitsterven sessie (of na een extra 60-min uitsterven sessie (s) die nodig zijn om het uitsterven criterium van 15 of minder respons vast te stellen), zijn dieren blootgesteld aan 20 min van intermitterende elektrische footshock stress (of sham- footshock) in de operante kamer. Footshock wordt gegeven tijdens een tijd waarin de actieve hendel is teruggetrokken en huis en stimulans lichten zijn gedoofd. Footshock wordt geleverd op basis van een variabele tijdschema bij een gemiddelde interval van 40 s (10-70 s bereik). Elke schok wordt toegediend met een intensiteit van 0,9 mA, en is 0,5 s in duur. Deze parameters van footshock zijn gebaseerd op uitgebreide proefprojectenuitgevoerd in ons laboratorium om betrouwbare herstel van cocaïne op zoek naar vast te stellen, met een minimum intensiteit en duur van footshock blootstelling. Onder deze parameters, dieren vertonen een reflexieve springen reactie op de 0,5 s schok, en af ​​en toe een korte stoten vocalisatie. Hoewel de dieren worden tijdens de hele periode van de schok, de intensiteit van de schok is niet van voldoende omvang voor het induceren meer uitgesproken tekenen van nood.
   7. Onmiddellijk na beëindiging van de footshock sessie, de actieve hefboom is uitgebreid en ratten mogen hefboom pers onder uitsterven omstandigheden (dat wil zeggen, zijn de reacties niet versterkt met cocaïne, maar blijven doen leiden tot verlichting van de stimulus licht en activering van de infuuspomp ). Deze periode wordt gedefinieerd als de test voor herstel en wordt meestal 1-3 uur duren. De meeste antwoorden vindt plaats in het eerste deel van de test sessie (eerste 30 min-1 uur), en vervolgens dooft meer uitgebreide testperiode. Dus een een uur test is voldoende om het herstel effect vast te leggen, met een langere testperiode met een meer volledige uitsterven profiel van het effect.
   8. Wanneer een herhaalde metingen design is toegepast, wordt elke rat getest onder footshock en sham footshock voorwaarden. Stappen 3.5.1. tot 3.5.8 worden herhaald op een volgende testdag, en de alternatieve test voor herstel (footshock of sham footshock) wordt toegediend.

4. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Gestileerde reactie profielen voor activiteit op de actieve en inactieve hendels tijdens de zelftoediening training, uitsterven, en het herstel testen.

Figuur 1 geeft gestileerd operant respons profielen, typisch van die verkregen tijdens de verschillende fasen van het experimentele protocol hierin beschreven.

1. Actieve hendel reacties

1. Cocaïne SA training. Figuur 1 (linker paneel) toont een typisch cocaïne SA training curve die zowel het aantal infusies en het totaal aantal actieve hefboom persen omvat. Ratten algemeen verwerven cocaïne SA binnen 1-3 sessies en, zodra het gedrag is gevestigd, een stabiele koers van inname van het geneesmiddel (meestal minder dan 20% tussen-sessie variantie) over de daaropvolgende sessies onderhouden.
2. Uitsterven van cocaïne-opgeleide gedrag. Het kan worden weergegeven in figuur 1 (middelste paneel) die op dag 1 van uitsterven, wanneer het antwoord niet-versterkt voor de eerste keer, het totale aantal reacties op de actieve hendel aanvankelijk hoger dan aan het einde van de trainingsfase (overeenkomend met een zogenaamde "uitsterven burst"), geleidelijk aan, over de vier uitsterven sessies, reageert af. Op dagen 2 en 3 van uitsterven, kan enig herstel te reageren (ten opzichte van die waargenomen tijdens de laatste zitting van de vorige dag) worden waargenomen, maar de reacties zijn over het algemeen minder dan aan het begin van de vorige dag van uitsterven, en uitsterven in het algemeen verloopt sneller over de vier sessies voor die dag.
3. Herstel van cocaïne zoeken. Het is te zien in Figuur 1 (rechter paneel) dat 20 min van de blootstelling aan periodieke footshock een toename van de niet-versterkte reageert op de actieve hendel, in verhouding tot die waargenomen aan het einde van de vorige sessie uitsterven induceert. Footshock veroorzaakt ook een toename te reageren ten opzichte van die waargenomen onder omstandigheden waarin schijnvertoning footshock wordt toegediend. Zo kan het herstel van de cocaïne die door footshock spanning ofwel worden uitgedrukt als: 1) de toename van het aantal niet-versterkte respons na blootstelling aan footshock ten opzichte van reacties in het uitsterven zitting vóór footshock of 2) de toename van het aantal niet-versterkte reacties na footshock ten opzichte van sham footshock.

2. Inactief hendel reacties

Het kan worden gezien in figuur 1 (rode lijn) dat, in alle experimentele fases, zijn er zeer lage respons die samenhangen met de inactieve hendel. Er is echter een bescheiden toename in reactie op deze hendel soms waargenomen na blootstelling aan footshock stress. Zelfs in gevallen waarin een dergelijke verhoging te reageren optreedt, de toename van de actieve hendel te reageren heeft de neiging om verhoudingsgewijs veel groter.

Discussion

In de afgelopen decennia zijn er drie varianten van de SA hernieuwde toelating is ontwikkeld om herstel van de drug die in het laboratorium ratten en apen te bestuderen. De verschillen die de procedurele variaties te definiëren hebben voornamelijk betrekking op de vraag of drugs SA, uitsterven en testsessies plaatsvinden binnen dezelfde dag of op verschillende dagen ^een. De procedure die wij hebben beschreven in dit artikel wordt meestal aangeduid als het "in-between" sessie variatie, omdat de drug SA optreedt tijdens de dagelijkse sessies (dat wil zeggen, in een tussen-sessie wijze) die los staan ​​van uitsterven en test sessies, maar uitsterven en testen komen op dezelfde dag (dat wil zeggen, in een binnen-sessie wijze) ^{[bv, 7, 9].} U kunt ook in de zogenaamde "tussen de sessies" procedures, alle fasen van het experiment plaatsvinden volgorde, zodanig dat SA, uitsterven, en het testen van sessies worden gegeven op verschillende dagen (dat wil zeggen, alle fases zijn tussen de sessies) [bv, ^{8, 10, 11].} In tegenstelling, in complete "binnen de sessies" procedures, SA training, uitsterven, en test sessies alle binnen dezelfde dag [bijv., ^12].

Hoewel er gepubliceerde rapporten van footshock-geïnduceerde herstel van de drug op zoek naar het gebruik van verschillende varianten van de hernieuwde toelating, hebben we vonden dit stressor (althans bij dieren met een geschiedenis van cocaïne SA) het meest effectief wanneer uitsterven en testen gebeuren op dezelfde dag (dat wil zeggen, in een "in-between"-sessies manier). Als alternatief hebben we succes gehad met het verkrijgen van betrouwbare footshock-geïnduceerde herstel van cocaïne op zoek naar het gebruik van een volledig "tussen sessies"-procedure, maar alleen onder omstandigheden waarin de dieren worden in de SA kamers gehuisvest gedurende het hele experiment ^acht, of op zijn minst tijdens het uitsterven en het testen ^13. Het nadeel van deze tussen-sessie benadering, meer dan die beschreven in het huidige protocol, is dat het het aantal onderwerpen die kunnen worden getraind en getest op een tijdslimieten en daardoor vermindert de efficiëntie van de gegevensverzameling. Hoewel onder de voorwaarden van het huidige protocol slechts een groep van dieren kan geblust worden en getest op een gegeven moment, kan een grotere verwerkingscapaciteit worden bereikt door maar liefst een week de starttijd van de SA opleidingsfase voor twee groepen van ratten. In dit scenario kan een eerste groep van ratten voer het drugsvrije fase als de tweede groep komt Week 2 van SA training, en vervolgens, uitsterven en testen kunnen worden uitgevoerd in de eerste groep, terwijl de tweede groep is in haar drug free-fase. Deze aanpak maakt een efficiënter gebruik van middelen en versnelt de snelheid van data-acquisitie, terwijl het leidt tot zeer effectieve en betrouwbare footshock-geïnduceerde herstel.

Belangrijk is dat in onze procedure, het uitsterven van de eerder drug versterkte gedrag en testen voor herstel optreedt in de aanwezigheid van drugs-geassocieerde cues. Hoewel we nog nooit uitgevoerd uitsterven training of testen in de afwezigheid van drugs-geassocieerde signalen, het is ons begrip, gebaseerd op persoonlijke communicatie, dat de stressor kan in feite niet effectief in het induceren van herstel bij het testen treedt in de afwezigheid van uitgedoofde cues ( althans in het geval van dieren met een geschiedenis van cocaïne SA). Een systematisch onderzoek van deze variabele, en de theoretische implicaties ervan uitgaat, is een belangrijke vraag voor toekomstig onderzoek.

Een laatste factor die garandeert procedurele opmerking is dat het effect van stress op footshock herstel lijkt te zijn zeer gevoelig voor manipulaties van context. Bijvoorbeeld, footshock stress is alleen effectief in het induceren van het herstel van de drug zoeken als het wordt toegediend in het milieu waarin drugs SA en uitsterven voorkomen, dat wil zeggen footshock doet drug die als blootstelling aan de stressor gebeurt niet opnieuw in een roman context, suggereert een belangrijke interactie tussen de stressor en drugs milieu in zijn effecten op herstel ^14.

Tot slot, footshock herstel procedures, zoals die beschreven in dit document, zijn gebruikt met veel succes aan de elementaire gedrags-en neurobiologische mechanismen die de relatie tussen stress en drugs terugval toe te lichten. Inderdaad, deze procedures, wanneer gemodificeerd om farmacologische voorbehandelingen of neurochemische manipulaties gericht op specifieke neuronale substraten tegemoet te komen, kan dienen als krachtige tools voor het karakteriseren van de neurobiologie van herstel om drugsgebruik zoeken door stress.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package		Med Associates, Inc.	MED-008-CT-B1
Deep extra tall MDF sound attenuating cubicle	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-018MD
Standard modular test chamber with drug infusion top and waste pan	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-008CT
Stainless steel grid floor	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-005
House light, hooded, 28V	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-215M
Stimulus light 1” white lens	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-221M
Low profile retractable response lever	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-112CM
SmartCtrl 8 Input/16 output package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	DIG-716P2
Single speed syringe pump, 3.33 RPM	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-100
Rat self infusion package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-119B-23-D
Drug Delivery, Arm assembly	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-110-SAI
Square wave aversive stimulator	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	ENV-414S
Patented quick disconnect harness for stainless steel grid floor	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	ENV-005-QD
Shock output cable	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	SG-219G-10
MED-PC IV Software	Software	Med Associates, Inc.	SOF-735