גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.
Abstract
גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.
Protocol
RNAi בתיווך להשתקת גנים ב יתושים דורש הכנה מוקדמת של טיהור dsRNAs ספציפי כי היעד הגן של עניין. לסינתזה dsRNA, אנו ממליצים על ערכת Megascript Ambion אשר עושה שימוש T7-RNA פולימראז בתיווך בתגובה שעתוק במבחנה. עבור טיהור dsRNA, אנו ממליצים על ערכת RNeasy Qiagen. דוגמאות dsRNA יש לכמת והותאמו …
Discussion
יעילות של השתקת הגן משתנה מאוד ותלוי במספר גורמים, כולל תמליל וחלבון להתהפך שיעורי, יעילות ספיגת dsRNA על ידי תאים ואיברים. מצאנו כי ההשתקה מתחיל מוקדם ככל 1 שלאחר הזרקת יום והוא יכול להימשך עד 6 ימים שלאחר הזריקה. השתמש תמליל וחלבון שיטות זיהוי כגון PCR כמותי ומערב סופג כדי לאמת את הה…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Megascript
kit
Ambion
for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy
Qiagen
For dsRNA purification
dsRNA
should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water