能力生产的转基因<em>线虫</em>使用fosmids进行基因组DNA作为保留所有原生的调控元件,是特别有吸引力。描述的是一个简单和强大的过程,通过生产转基因的重组工程<em> galK</em>选择标记。
转基因动物的建立是广泛使用在 C 线虫的研究,包括研究有关规例及利益或代串联亲和纯化(TAP)的标签的特定基因的版本,以方便其净化的基因表达模式的使用GFP融合蛋白。典型的转基因是通过配售上游启动子的GFP报告基因或cDNA利益的产生,这往往产生一个代表性的表达模式。然而,基因调控的关键要素,如控制在3'非编码区或替代促销员元素,,可以错过这种方法。进一步只有一个单一的拼接变异体,通常可以通过,这意味着研究。相比之下,使用fosmid DNA克隆的蠕虫病毒基因组进行DNA的可能包括大多数,如果不是在基因调控在体内 ,它允许更大的能力,捕捉到真正的表达模式和时序所涉及的所有元素。为了方便使用fosmid DNA的转基因代,我们描述了一个E 。 大肠杆菌基于重组工程的程序,绿色荧光蛋白,TAP标签,或其他感兴趣的序列插入到任何基因的位置。该过程使用都在重组工程的正面和负面的选择步骤,高效率地获得所需的修改结果 galK基因作为选择标记。此外,包含galK基因两侧常用的绿色荧光蛋白的同源性武器和TAP融合基因的质粒可减少50%的成本寡核苷酸时产生的GFP或TAP融合蛋白。这些质粒使用R6K复制起点,这就排除了需要进行广泛的PCR产物纯化。最后,我们还展示了技术集成允许fosmid直接注射或轰击成蠕虫产生转基因动物的fosmid骨干UNC – 119标记。这个视频演示,通过使用这种方法重组工程生成转基因有关手续。
转基因从fosmids一代提供保留所有本机的启动子,剪接变异体,和3'非编码区调控元件的利益。这可能会导致一个转基因这是原生的表达模式,或建设功能的基因,当其他方法失败5反射的建设。由此产生的转基因可以进行各种包括GFP或自来水标记的抗原表位的标签。
转基因的建设涉及到三个步骤都进行SW106细菌染色 15 。首先,galK基因融入在fosmid所需?…
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢纳什与发展中国家的技术帮助林赛。这项工作是由美国国立卫生研究院授予AG028977 ALF的,从美国匹兹堡大学的一个OAIC匹兹堡大学(AG024827),种子基金的试点项目授予。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
GoTaq | Promega | M7122 | ||
MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
D-galactose | Sigma | G0750 | ||
2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
Biotin | Sigma | B4639 | ||
Leucine | Sigma | L8000 | ||
NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
Arabinose | Sigma | A3131 | ||
Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
Glycerol | Sigma | G2025 | ||
Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |