Способность производить трансгенов для<em> Caenorhabditis Элеганс</em> Использование геномной ДНК несет fosmids особенно привлекателен, как и все родные регуляторные элементы сохраняются. Описывается простой и надежной процедуры для производства трансгенов через recombineering с<em> GalK</em> Селективного маркера.
Создание трансгенных животных широко применяется в C. Элеганс исследований, включая использование белков GFP слияния для изучения регуляции и экспрессии генов интересов или поколение очистки тандеме сродством (TAP) меткой версии специфических генов для облегчения их очистки. Как правило трансгенов создаются путем размещения промоутер перед геном GFP репортера или кДНК, представляющих интерес, и это часто приводит к представителю выражению. Тем не менее, критические элементы регуляции генов, таких как элементы управления в нетранслируемой области 3 'или альтернативных промоторов, может не хватать такого подхода. Далее только один вариант сплайсинга могут быть изучены обычно это означает. В противоположность этому, использование червя геномной ДНК несет клонов ДНК fosmid вероятно, включает в себя большинство, если не все элементы, участвующие в регуляции генов в естественных условиях, которая позволяет более широкие возможности для захвата подлинной выражению и сроки. Для облегчения поколения трансгенов использованием fosmid ДНК, мы описываем Е. кишечной основан recombineering процедуры для вставки GFP, TAP-тег, или другие последовательности интереса в любом месте в геном. Процедура использует galK гена как выбор маркера для позитивной и негативной селекции шаги в recombineering что приводит к получению желаемого модификация с высокой эффективностью. Кроме того, плазмиды, содержащие ген galK окружении гомологии оружия обычно используются GFP и TAP слияние генов доступны, которые снижают стоимость олигонуклеотидов на 50% при генерации или белка GFP TAP синтеза. Эти плазмиды использовать происхождения R6K репликации что исключает необходимость широкого очистки продуктов ПЦР. Наконец, мы также продемонстрировать технику для интеграции UNC-119 маркеров на fosmid основу, которая позволяет fosmid напрямую вводили или бомбардировке в червей для получения трансгенных животных. Это видео демонстрирует процедур, необходимых для создания трансгенных через recombineering используя этот метод.
Поколения трансгенов из fosmids предлагает благо сохраняя все родную стихию промоутер, сращивание вариантов, и 3 'UTR регуляторных элементов. Это может привести к строительству трансгенов которая в большей степени соответствовали родной выражению, или строительство функциональных тран?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Линдси Нэш за помощь в развитии техники. Эта работа финансировалась NIH грант AG028977 для ALF, грант пилотного проекта из Университета Питтсбурга OAIC (AG024827), а также семян средств из Университета Питтсбурга.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
GoTaq | Promega | M7122 | ||
MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
D-galactose | Sigma | G0750 | ||
2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
Biotin | Sigma | B4639 | ||
Leucine | Sigma | L8000 | ||
NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
Arabinose | Sigma | A3131 | ||
Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
Glycerol | Sigma | G2025 | ||
Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |