Western Blot: Preparación de muestras para la detección
Summary
Western Blot es una técnica analítica para detectar proteínas específicas en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto.
Abstract
Western Blot es una técnica analítica para detectar proteínas específicas en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto. Se utiliza la electroforesis en gel para separar las proteínas nativas o desnaturalizadas por la longitud del polipéptido (condiciones desnaturalizantes) o por la estructura 3-D de la proteína (nativo / condiciones no desnaturalizantes). Las proteínas se transfieren a una membrana (por lo general de nitrocelulosa o PVDF), donde se sondean (detectado), utilizando anticuerpos específicos para la proteína diana.
Protocol
1. Preparación de la muestra El primer paso en el Western Blot es la preparación de muestras. Para preparar las muestras para el funcionamiento de un gel de células y tejidos deben ser zadas para liberar las proteínas de interés. Un práctico, listo para el uso de reactivos que es versátil y fácil de usar para la extracción de proteína soluble es CytoBuster o PhosphoSafe. Estos topes de extracción contienen detergentes optimizó para la extracción eficaz de las proteínas solubles de las células de mamíferos e insectos. La suave y no iónicos composición del Reactivo CytoBuster extracción de la proteína permite el aislamiento de la endógena funcionalmente activas o proteínas que se expresan sin necesidad de tratamiento secundario, tales como ultrasonidos o de congelación / descongelación. PhoshoSafe tiene el beneficio añadido de que contiene cuatro inhibidores de la fosfatasa. Precipitar las células por centrifugación a baja velocidad (por ejemplo, 5 minutos a 2500 xg), drenar el sedimento celular también. Resuspender las células en el reactivo CytoBuster extracción de proteínas utilizando 150 l por cada 10 6 células (cantidad óptima de reactivo CytoBuster extracción de la proteína puede variar según el tamaño de la celda). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Transferir a un tubo adecuado y vuelta durante 5 minutos a 16.000 xga 4 ° C. Transferencia despejado sobrenadante (extracto de células) a un tubo nuevo y proceder a su análisis. Para la extracción de proteínas especializadas, se recomienda utilizar nuestros productos de alta calidad Kits ProteoExtract. EMD tiene más de una docena de kits para el aislamiento de las mitocondrias, la extracción de proteoma subcelular, la extracción de la proteína transmembrana, y muchos otros. Por favor, visite nuestra página de Western blot de aterrizaje para más detalles. EMD también vende una amplia variedad de juegos de la proteasa y fosfatasa inhibidor de cóctel. Tan pronto como se produce la lisis, la proteolisis, desfosforilación y la desnaturalización de comenzar. Estos eventos se puede ralentizar enormemente si las muestras se mantienen en hielo oa 4 ° C en todo momento y los inhibidores adecuados se agregan a la nueva solución amortiguadora de lisis. Por favor, visite nuestra página de Western blot de aterrizaje para más detalles. 2. SDS-PAGE El segundo paso en el Western Blot es la separación de proteínas. Las proteínas se separan en función del peso molecular. Usted puede hacer su gel propia página, sin embargo, va a utilizar un comercial prefabricado gel. Después de preparar la muestra, usted está listo para determinar la concentración de proteínas. EMD tiene dos juegos para esta medición de la concentración, uno es el kit de proteínas sin interferencia de ensayo y el otro es el BCA Protein Kit de ensayo. Una vez que la concentración de proteína se determina que estamos listos para preparar la muestra para la carga del gel. Los anticuerpos suelen reconocer una pequeña porción de la proteína de interés (en adelante, el epítopo) y este dominio pueden residir dentro de la conformación 3D de la proteína. Para habilitar el acceso de los anticuerpos a esta parte es necesario para desplegar la proteína. Para desnaturalizar, use un tampón de carga con los aniónicos sulfato de sodio dodecil detergente desnaturalizante (SDS), y hervir la mezcla a 95-100 º C durante 5 minutos. Un tampón de carga fácil y cómodo de usar es la muestra de amortiguación 4X. Cargue el primer carril del pozo con marcador de proteína Trail Mix. Este marcador tiene tres bandas de referencia que le permiten controlar la electroforesis. Cuando el gel se tiñe, 10 bandas son visibles que van desde 10 hasta 225 kDa. Llene la unidad de electroforesis con el correr de amortiguación. Por PAGE, esto es por lo general 1X Tris-glicina. Para recetas de amortiguación más detallada, visite la página de Western Blot. EMD ofrece una alta calidad de los reactivos tampones con nuestra línea de productos químicos OmniPur. Correr el gel a 220V durante 1 hora. Una vez que las proteínas se han separado, tinción del gel con azul de Coomassie para asegurar que las proteínas han emigrado de manera uniforme y uniformemente. RAPIDstain es una mancha de ultra-sensible, que está listo para usar. No es necesario decolorar. 3. La proteína de transferencia Al igual que las proteínas con una carga eléctrica puede ser inducida a viajar a través de un gel en un campo eléctrico, por lo que las proteínas pueden ser transferidos de un campo eléctrico a partir del gel a una membrana, ya sean PVDF o nitrocelulosa. Hoy vamos a hacer una transferencia de humedad. En la transferencia de humedad, el gel y la membrana se intercala entre la esponja y papel (esponja / papel / gel / membrana / papel / esponja) y todos están apretados juntos después de que garantiza que no se han formado burbujas de aire entre el gel y la membrana. El sándwich se sumerge en tampón de transferencia al que se aplica un campo eléctrico. Las proteínas con carga negativa de viaje hacia el electrodo con carga positiva, pero la membrana se lo impide, se une a ellos, y les impide continuar. Dos tipos de membranas disponibles: nitrocelulosa y PVDF. Ambos trabajan bien. Hoy vamos a estar utilizando PVDF. Membranas de PVDF requieren remojo en methanol durante unos minutos, seguida de transferencia de buffer fría durante 5 minutos. El gel también tiene que equilibrar durante unos minutos en tampón de transferencia helada. No hacerlo puede reducir el tamaño del gel durante la transferencia. El buffer para la transferencia de humedad es 1X Tris-glicina con un 20% de metanol. Preparación detallada de búfer están disponibles en nuestro sitio web. Una vez que se complete la transferencia, es una buena idea para visualizar las proteínas para asegurar una transferencia sin bolsas de aire. Esto se puede hacer fácilmente con RedAlert Western Blot manchas. Esta mancha está listo para su uso y la decoloración se puede hacer fácilmente con agua. 4. Anticuerpos y reactivos de accesorios El primer paso para hacer de sondeo y de anticuerpos contra el antígeno es bloquear la membrana. El bloqueo de la membrana impide la unión no específica de fondo. Ya sea de leche sin grasa o BSA se puede utilizar como una solución de bloqueo. Sin embargo, cuando se utiliza fosfato anticuerpos específicos, no se recomienda el uso de la leche, ya que será causa de fondo de alta. EMD ofrece varios reactivos de alta calidad de bloqueo, incluyendo SeaBlock, que es un agente de animales no mamíferos bloqueo y QuickBlocker BLOT, que es preparado, listo para usar agente de bloqueo. También contamos con alta calidad de BSA (fracción V) disponibles. Incubar la membrana de 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. Lavar tres veces en PBST TBST o después de la incubación. Una manera fácil y conveniente de hacer TBST o PBST es utilizar nuestro tabletas (comprimidos PBS Tween / tabletas ENTRE TBS) Una vez que la membrana ha sido bloqueado, usted está listo para la incubación con el anticuerpo primario. EMD ha estado ofreciendo una amplia cartera de anticuerpos excepcional con la mejor garantía de anticuerpos en la industria por más de 30 años. Recuerde que con todos los anticuerpos EMD, ofrecemos un 100% sin riesgo de garantía. Compra de un anticuerpo y lo utilizan para cualquier especificidad de especie o de la aplicación que desee. Si el anticuerpo no funciona a su satisfacción, le daremos un crédito completo para ser utilizado en cualquier otro producto. Para más detalles, por favor visite nuestra página de Western blot web. Hoy vamos a estar incubando el anticuerpo primario utilizando nuestra solución al 1 de SignalBoost. SignalBoost es un gran producto que permite la señal para ser mejorada de manera significativa. Simplemente incubar su anticuerpo primario en la Solución 1 y se incuba durante 1 hora o como lo haría normalmente. No hay necesidad de agregar más agentes de bloqueo. Alternativamente, puede utilizar BSA o leche descremada en polvo como un agente de bloqueo. Lavar con TBST. Hacemos TBST utilizando la lista a disolver la tableta TBST. Incubar el anticuerpo secundario utilizando la solución de dos de SignalBoost. Incubar con el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo durante 1 hora. Lavar la membrana de nuevo varias veces con TBST. 5. Detección HRP para conjugar anticuerpos secundarios, ECL se utiliza tradicionalmente. Un reactivo ECL excelente que ofrecemos es RapidStep. Las ventajas de RapidStep es que no hay mezcla de luminal o potenciador es necesario. Simplemente rocíe la membrana de un par de veces y desarrollar el uso de las placas radiográficas. RapidStep ofrece una sensibilidad pictograma baja, así como emisores de luz de hasta 2 horas después de la adición del substrato.
Discussion
En este vídeo de presentación, hemos destacado los pasos más importantes en Western Blot, que son la preparación de muestras, SDS-PAGE, la membrana de bloqueo / sondeo con anticuerpos, y la detección. Para cada paso del proceso, los protocolos adecuados y reactivos adecuados se deben utilizar para lograr resultados de alta calidad.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. ‘. W. e. s. t. e. r. n. blotting’: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , (2010).
- O’Malley, D. e. r. v. i. a. Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
Citer Cet Article
Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359, doi:10.3791/2359 (2010).