Western Blot: Numune Hazırlama Algılama
Summary
Western blotting, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek özel proteinleri tespit etmek için kullanılan analitik bir tekniktir.
Abstract
Western blotting, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek özel proteinleri tespit etmek için kullanılan analitik bir tekniktir. Bu polipeptid uzunluğu (denatüre koşulları) veya 3-D protein yapısı (yerli / olmayan denatüre koşulları) yerli veya denatüre proteinleri ayırmak için jel elektroforezi kullanır. Proteinler daha sonra hedef protein spesifik antikorlar kullanarak probed bir zar (genellikle nitroselüloz veya PVDF), (tespit) aktarılır.
Protocol
1. Numune Hazırlama Western blot ilk adım, numune hazırlama. Jel hücre ve dokuların çalıştırmak için numune hazırlamak için ilgi proteinleri serbest parçalanmış olması gerekir. Çok yönlü ve çözünür protein ekstraksiyonu için kullanımı kolay bir kullanıma uygun, hazır reaktif CytoBuster veya PhosphoSafe. Bu çıkarma tamponlar, memeli ve böcek hücrelerinin çözünen proteinlerin etkin bir şekilde çıkarılması için optimize edilmiş deterjan içerir. CytoBuster Protein Ekstraksiyonu Reaktif nazik, non-iyonik bileşimi gibi sonication veya donma / çözülme gibi ikincil tedavi için gerek kalmadan işlevsel aktif endojen veya ifade proteinlerin izolasyonu sağlar. PhoshoSafe dört fosfataz inhibitörleri içeren eklenen yararı vardır. Pelet düşük hızda santrifüj (örneğin 2500 xg'de 5 dakika) hücreleri, iyi drenaj hücre pelletini. CytoBuster Protein Ekstraksiyonu Reaktif 10 6 hücre başına 150 mcL (CytoBuster Protein Ekstraksiyonu Reaktif optimal miktarı hücre boyutuna göre değişebilir) kullanarak hücrelerin tekrar 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Uygun bir tüp transferi ve 4 ° C 16.000 xg'de 5 dakika spin Transfer yeni bir tüp (hücre özü) supernatant temizlenir ve analizi ile devam edin. Uzman protein izolasyonu için, bizim yüksek kaliteli ProteoExtract Kitleri kullanmanızı öneririz. EMD mitokondriyal yalıtımı, hücre içi proteom çıkarma, transmembran protein izolasyonu, ve diğerleri için bir düzineden fazla kitleri vardır. Daha fazla ayrıntı için Western Blot açılış sayfasını ziyaret edin. EMD proteaz, fosfataz inhibitörü kokteyl setleri geniş bir yelpazede satıyor. Lizis olarak ortaya çıkar, proteoliz, Defosforilasyon ve denatürasyon başlar. Bu olaylar örnekleri, buz üzerinde veya 4 tutulur muazzam yavaşlamış olabilir ° C her zaman ve uygun inhibitörleri, lizis tamponu taze eklenir. Daha fazla ayrıntı için Western Blot açılış sayfasını ziyaret edin. 2. SDS-PAGE Western blotting ikinci adım protein ayırma. Proteinler moleküler ağırlığına göre ayrılır. Kendi SAYFA jel yapabilir, ancak biz ticari prekast jel kullanarak olacak. Numunenin hazırladıktan sonra, protein konsantrasyonu belirlemek için hazırsınız. EMD konsantrasyonu ölçmek için bu iki kitleri, bir Sigara Karışan Protein Testi Kit ve diğer BCA Protein Testi Kiti. Protein konsantrasyonu değerlendirilir sonra jel yükleme için bizim örnek hazırlamak için hazır. Antikorlar genellikle ilgi protein küçük bir kısmı (epitopu olarak anılacaktır) tanımak ve bu etki, protein 3D konformasyon içinde ikamet olabilir. Antikor, protein açılmak için gerekli olan bu kısmına erişim sağlamak için. Doğasını, denatüre anyonik deterjan sodyum dodesil sülfat (SDS) ile bir yükleme tampon kullanmak ve karışımı 95-100 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatın. Kullanımı kolay ve rahat bir yükleme tamponu 4X Örnek Arabelleği. Trail Mix Protein Marker ile iyi ilk şeritli yükleyin. Bu marker, elektroforez izlemek için izin üç referans bantları vardır. Jel lekeli, 10-225 kDa arasında değişen 10 bantlar görülebilir. Tampon çalışan elektroforez doldurun. SAYFA jeller için bu Tris-glisin genellikle 1X. Ayrıntılı tampon tarifleri için, Western blot sayfasını ziyaret edin. EMD OmniPur kimyasal hattı ile yüksek kaliteli tamponlar reaktifler sunar. 1 saat süreyle 220V jel çalıştırın. Proteinler ayrılmış sonra, proteinler eşit ve düzgün göç etmiş sağlamak için Coomassie mavi ile jel leke. RAPIDstain kullanıma hazır olduğu ultra hassas bir leke. Yok destaining gereklidir. 3. Protein Aktarımı Bir elektrik yükü ile proteinler gibi bir elektrik alanında bir jel ile seyahat ikna edilebilir, bu nedenle proteinler, PVDF veya nitroselüloz ya bir zar üzerine jel bir elektrik alanı içinde transfer olabilir. Bugün biz ıslak bir transfer yapacağız. Islak transferi, jel ve membran sünger ve kağıt (sünger / kağıt / jel / membran / kağıt / sünger) ve herhangi bir hava kabarcığı, jel ve membran arasında oluşan sağlamak sonra sıkıca birbirine kenetlenir arasında sıkışmış. Sandviç, bir elektrik alanı uygulandığında transfer tampon batmış. Negatif yüklü proteinler pozitif yüklü elektrot doğru seyahat, ancak membran onları durdurur, onları bağlar, ve devam etmesini engeller. Membran iki tip mevcuttur: nitroselüloz ve PVDF. De her iki çalışma. Bugün PVDF kullanarak olacak. PVDF membranlar methano iliklerine gerektirir.birkaç dakika için l, 5 dakika buz transfer tampon ile takip. Jel, buz gibi transfer tamponunda bir kaç dakika da dengeye ihtiyacı var. Bunu yapmamak, transfer sırasında jel brakabilir. Islak transferi için tampon% 20 metanol ile 1X Tris-glisin. Detaylı tampon hazırlıkları web sitemizde mevcuttur. Transferi tamamlandıktan sonra, bunu sağlamak için bile herhangi bir hava ceplerine transfer proteinlerinin görselleştirmek için iyi bir fikirdir. Bu RedAlert Western Blot Leke ile kolayca yapılabilir. Bu leke kullanıma hazırdır ve destaining su ile kolayca yapılabilir. 4. Antikorlar ve Aksesuar Reaktifler Antijene sondalama ve antikor yapıyor membran engellemek için ilk adım. Membran engelleme non-spesifik bir arka plan bağlanmasını engelleyen. Yağsız süt veya BSA Ya engelleyici bir çözüm olarak kullanılabilir. Ancak, fosfor-spesifik antikorların kullanırken, yüksek arka plan neden olarak süt kullanmak için tavsiye değildir. EMD olmayan bir memeli engelleyici ajan ve hazırlanan BLOT QuickBlocker SeaBlock dahil olmak üzere çok sayıda yüksek kaliteli engelleme reaktifler, hazır kullanımı ajan engelleme. Ayrıca yüksek kaliteli BSA (Fraksiyon V) var. Membran yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1 saat inkübe. TBST veya PBST inkübasyondan sonra üç kez yıkayın. TBST veya PBST yapmak için kolay ve rahat bir şekilde tabletleri kullanmak için (PBS TWEEN Tablet / TBS TWEEN Tablet) Membran bloke edildikten sonra, primer antikor ile inkübe hazırız. Merck, 30 yılı aşkın süredir endüstride en iyi antikor garantisi ile, olağanüstü antikorların kapsamlı bir portföy sunmaktadır. Tüm EMD antikorlar, biz tam% 100 risk garantisi teklif unutmayın. Antikor satın alma ve İstediğiniz herhangi bir tür özgüllüğü veya uygulama için kullanabilirsiniz. Antikor sizi tatmin edecek işe yaramazsa, başka bir ürün üzerinde kullanılmak üzere tam bir kredi sağlayacaktır. Daha fazla bilgi için, Western blot web sayfasını ziyaret edin. Bugün SignalBoost, çözüm 1 kullanarak birincil antikor kuluçka olacaktır. SignalBoost sinyali önemli ölçüde geliştirilmiş olmasını sağlayan harika bir ürün. Sadece birincil antikor Çözüm 1 inkübasyon ve 1 saat boyunca veya normalde yaptığınız gibi kuluçkaya yatmaktadır. Daha fazla bloke edici ajanlar eklemeye gerek yoktur. Alternatif olarak, BSA veya engelleyici bir ajan olarak yağsız süt kullanabilirsiniz. TBST ile yıkayın. Biz hazır çözülür TBST tablet TBST olun. SignalBoost, çözüm 2 kullanarak ikincil antikor inkübe edin. 1 saat boyunca tampon engelleme ikincil antikor inkübe edin. TBST ile birkaç kez membran yıkayın. 5. Bulma HRP conjugating ikincil antikorlar, ECL geleneksel olarak kullanılır. Sunduğumuz mükemmel bir ECL reaktif RapidStep. RapidStep, avantajları luminal veya artırıcı hiçbir karıştırma gerekli olduğunu. Sadece membran birkaç kez sprey ve x-ışını filmi kullanarak geliştirmek. RapidStep substrat eklenmesinden sonra düşük piktogram yanı sıra 2 saate yayan ışık hassasiyeti sunuyor.
Discussion
Bu video sunumu, SDS-PAGE, membran antikorlar ile sondalama / engelleme ve algılama, numune hazırlama, Western blot önemli adımlar sermiştir. Sürecinin her adımı için uygun protokoller ve uygun reaktifler, yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için kullanılmalıdır.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. ‘. W. e. s. t. e. r. n. blotting’: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , (2010).
- O’Malley, D. e. r. v. i. a. Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
Citer Cet Article
Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359, doi:10.3791/2359 (2010).