Het testen van oppervlakte-expressie van receptoren Chemosensory in heterologe cellen
Summary
Hier laten we zien een protocol voor het uitvoeren van live cell vlekken die kunnen worden gebruikt om de geurstof receptoren gemakkelijk te detecteren op het oppervlak van HEK293T cellen. Daarnaast kan het ook worden gebruikt om de analyse voor oppervlakte-expressie van andere chemosensory receptoren of GPCR's.
Abstract
De levendige wereld van geuren is erkend door het gevoel van reukzin. Reukzin bij muizen wordt gemedieerd door een repertoire van ongeveer 1200 G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) 1, die verondersteld dat vluchtige odorant moleculen binden en het omzetten van de extracellulaire signaal om in een intracellulaire signaal door koppeling met G-eiwit Gαolf. Binding van de geurstoffen aan de receptoren wordt beschouwd als een combinatorische regel, dat is een geurstof, kan binden verschillende receptoren en een receptor kan verschillende geurstoffen te binden in verschillende mate 2 te volgen. Biochemische, signalering en ligand binding studies zijn geschikt uitgevoerd voor de meeste GPCR's met behulp van heterologe cellen. Maar van heterologe cellen gebruiken voor de studie van odorant receptoren, was uitgesloten voor een lange tijd geleden op transfectie ze niet exporteren naar de oppervlakte. Saito et al. hebben aangetoond dat een membraan passeren Receptor Transport Protein (RTP) familie begeleiders verhoogde expressie zien in de olfactorische sensorische neuronen en treden op als begeleiders om het verkeer odorant receptoren aan de oppervlakte in heterologe cellen, bij gelijktijdige samen getransfecteerd 3. Voor het uitvoeren van biochemische assays voor het gebruik van heterologe receptoren cellen, moet men eerst nagaan of de receptor vertoont robuuste oppervlakte-expressie in de cel lijn. Dit kan worden getest door overexpressie van de receptoren met de begeleider RTP1S, gevolgd door live-cell kleuring om fluorescent label het extracellulaire domein of een tag in het extracellulaire domein exclusief. Hier laten we zien een protocol voor het uitvoeren van live cell vlekken die kunnen worden gebruikt om de geurstof receptoren gemakkelijk te detecteren op het oppervlak van HEK293T cellen. Daarnaast kan het ook worden gebruikt om de analyse voor oppervlakte-expressie van andere chemosensory receptoren of GPCR's.
Protocol
Discussion
Elke stap moet worden uitgevoerd zorgvuldig te prominent en onderscheidend oppervlak vlekken zorgen. Het gehele kleuring proces moet worden uitgevoerd in koud (op ijs), en de lade waarop de dekglaasjes worden gelegd dient vooraf te worden gekoeld om te gebruiken om ervoor te zorgen cellen in leven te blijven. Bovendien fixatie wordt gedaan aan het eind van het oppervlak beitsen. Dit staat in schril contrast met de interne kleuren waar fixatie voorafgaat vlekken op de celmembraan permeabilize aan primaire en secundaire a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Matsunami laboratorium voor kritische lezing van dit manuscript.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
