Heterolog Hücreler kimyasal-duyusal reseptörleri Yüzey İfade Assaying
Summary
Burada odorant reseptörleri HEK293T hücrelerinin yüzeyinde rahatlıkla tespit etmek için kullanılan olabilir canlı hücre boyama yürütmek için bir protokol göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda, diğer kimyasal-duyusal reseptörleri veya GPCRs yüzey ekspresyonu tahlil için kullanılır.
Abstract
Kokuları koku alma duygusunu canlı dünya tarafından kabul edilmektedir. Farelerde koku, uçucu odorant molekülleri bağlamak için öne ve G proteini Gαolf ile kaplin bir hücre içi sinyal ekstraselüler sinyal dönüştürme yaklaşık 1200 G Protein Coupled reseptörleri (GPCRs) 1 bir repertuar ile meydana gelir . Koku reseptörleri bağlayıcı, çeşitli reseptörler bir odorant bağlamak ve bir reseptör derece 2 değişen çeşitli koku bağlamak Kombinatoryal kural takip etmek düşünülmektedir. Biyokimyasal, sinyalizasyon ve ligand bağlanma çalışmaları uygun heterolog hücreleri kullanarak en GPCRs için yürütülen edilmiştir. Ancak, transfeksiyon yüzeye ihracat başarısız beri odorant reseptörlerinin çalışma için heterolog hücrelerinin uzun bir süre engellediği. Saito et al aile şaperonlar co birlikte 3 transfekte heterolog hücrelerinin yüzeyinde, trafik odorant reseptörleri şaperonlar olarak koku duyusal nöronlar ve hareket gelişmiş ifade Protein taşınması tek zarından geçişine Reseptör (RTP) göstermiştir. Reseptör hücre hattı sağlam yüzey ekspresyonu gösterir heterolog hücreleri kullanarak reseptörleri için biyokimyasal testleri yürütmek için bir ilk belirlemeniz gerekir. Bu canlı hücre floresan ekstrasellüler özel ekstrasellüler etki alanı veya bir etiket etiket boyama takip şaperon RTP1S reseptörleri eksprese tarafından test edilebilir. Burada odorant reseptörleri HEK293T hücrelerinin yüzeyinde rahatlıkla tespit etmek için kullanılan olabilir canlı hücre boyama yürütmek için bir protokol göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda, diğer kimyasal-duyusal reseptörleri veya GPCRs yüzey ekspresyonu tahlil için kullanılır.
Protocol
Discussion
Her adım, belirgin ve ayırt edici bir yüzey boyama sağlamak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tüm boyama işlemi soğuk (buz) yürütülen olmalıdır ve kapak fişleri hangi tepsiye serilir hücreleri hayatta kalmak sağlamak için kullanmadan önce soğutulması gerekir. Ayrıca fiksasyon yüzey boyama sürecinin sonunda yapılır. Bu fiksasyon birincil ve ikincil antikorlar hücre zarı permeabilize boyama önce iç boyası ile keskin bir kontrast. Hücreleri kurumasını önlemek için kapak fişleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının eleştirel okuma Matsunami laboratuvar üyelerine teşekkür ediyorum.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
