Опробование поверхностного Выражение хемосенсорных рецепторов в клетках Гетерологическая
Summary
Здесь показано, протокол проводить окрашивание живой элемент, который может быть использован для обнаружения одоранта рецепторами на поверхности клетки HEK293T удобно. Кроме того, она также может быть использована для анализа на поверхности экспрессию других хемосенсорных рецепторов или GPCRs.
Abstract
Яркий мир запахов признается чувство обоняния. Обоняние у мышей опосредованы репертуаре около 1200 G белком рецепторы (GPCR) 1, которые постулируются для связывания летучих молекул одоранта и преобразования внеклеточного сигнала в внутриклеточного сигнала связи с G белком Gαolf. Связывание одорантов на рецепторы, как полагают, следовать комбинаторной правило, то есть тот, одоранта может связывать несколько рецепторов и одного рецептора может связывать несколько отдушки и в разной степени 2. Биохимические, сигнализации и связывание лигандов исследований было удобно проводить для большинства GPCRs использовании гетерологичной клеток. Однако использование гетерологичной клеток для изучения рецепторов одоранта, была исключена в течение длительного времени, так как на трансфекции им не удалось экспортировать на поверхность. Сайто и др. показали, одного рецептора мембраны проходят Транспортировка белка (RTP) семья сопровождающих шоу повышенной экспрессии в обонятельной сенсорных нейронов и выступают в качестве сопровождающих для движения одоранта рецепторами на поверхности клетки в гетерологичных, когда совместно трансфицированных вместе 3. Для проведения биохимических анализов для рецепторов использовании гетерологичной клетки, нужно сначала определить, если рецептор показывает надежную выражение поверхности клеточной линии. Это может быть проанализированы по гиперэкспрессией рецепторов с сопровождающим RTP1S последующим окрашиванием живой клетки к флуоресцентно этикетке внеклеточного домена или тег в внеклеточный домен исключительно. Здесь показано, протокол проводить окрашивание живой элемент, который может быть использован для обнаружения одоранта рецепторами на поверхности клетки HEK293T удобно. Кроме того, она также может быть использована для анализа на поверхности экспрессию других хемосенсорных рецепторов или GPCRs.
Protocol
Discussion
Каждый шаг должен быть проведена тщательно, чтобы гарантировать известных и отличительные поверхности окрашивания. Весь процесс окрашивания должны выполняться в холодную (на льду), и подносом, на котором крышка скользит проложены должен быть охлажден до использования, чтобы обеспечи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Мацунами лабораторию для критического чтения этой рукописи.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
