Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor<em> In Vitro</em
Summary
Nós apresentamos o procedimento para a fabricação e operação de um dispositivo micro que recria heterogêneos microambientes tumorais<em> In vitro</em>. A variabilidade na apoptose dentro do tecido do tumor foi quantificada usando manchas fluorescentes e do coeficiente de difusão eficaz da doxorrubicina droga quimioterapêutica para o tecido do tumor foi avaliada.
Abstract
Desenvolvemos um dispositivo de microfluidos, que imita a entrega e depuração sistémica da droga a heterogéneos tridimensionais tecidos tumorais in vitro. Nutrientes fornecidos pela vasculatura não cheguem a todas as partes de tumores, dando origem a microambientes heterogéneos constituídos por tipos de células viáveis, quiescentes e necróticas. Muitos medicamentos contra o câncer não conseguem penetrar eficazmente e tratar todos os tipos de células por causa dessa heterogeneidade. As monocamadas de células cancerosas não imitam esta heterogeneidade, tornando-o difícil de testar drogas de cancro com um modelo in vitro apropriado. Nossos dispositivos microfluídicos foram fabricados fora do PDMS utilizando litografia macia. Esferóides multicelulares de tumores, formadas pelo método de gota suspensa, foram inseridos e constrangidos em câmaras rectangulares sobre o dispositivo e mantida com perfusão contínua meio de um dos lados. A forma rectangular das câmaras do dispositivo criado gradientes lineares dentro do tecido. Manchas fluorescentes foram utilizados para quantificar thvariabilidade e na apoptose dentro do tecido. Tumores do dispositivo foram tratados com a droga quimioterapêutica fluorescente doxorrubicina, microscopia de lapso de tempo foi usado para controlar a sua difusão para o tecido, e o coeficiente de difusão eficaz foi estimada. O método de gota pendente permitiu rápida formação de esferóides uniformes de várias linhas de células cancerosas. O dispositivo activado crescimento de esferóides por até 3 dias. As células na proximidade do fluxo médio foram minimamente apoptótica e aqueles longe do canal foram mais apoptótica, o que precisamente imitando regiões em tumores adjacentes a vasos sanguíneos. O valor estimado do coeficiente de difusão doxorrubicina concordou com um valor previamente relatada em câncer de mama humano. Porque a penetração e retenção de drogas em tumores sólidos afecta a sua eficácia, acreditamos que este dispositivo é uma importante ferramenta na compreensão do comportamento de drogas, e desenvolvimento de terapias do cancro novos.
Protocol
Discussion
A vasculatura em tumores é escassa e mal desenvolvidos 7,8. Existem regiões localizadas longe (> 100 um) a partir de vasos sanguíneos que são inacessíveis aos nutrientes e medicamentos fornecidos embora o 9 vasculatura. O microambiente heterogénea resultante contribui para a eficácia limitada de muitos agentes quimioterapêuticos 10. O dispositivo micro desenvolvido aqui recria um microambiente do tumor heterogéneo caracterizado por proliferação, as células quiescentes e ap…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde concessão # 1R01CA120825-01A1, a Pesquisa Colaborativa Biomédica (CBR) Programa da Universidade de Massachusetts Amherst, e da Bolsa de Isenberg para Bhushan J. Toley. Agradecemos a valiosa contribuição de Tiago Schafer, o cinegrafista, narrador e editor deste vídeo.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole Parmer | EW-06417-31 | 0.032″ ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5″ needles | BD Bioscience | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro. Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).
- Walsh, C. L. A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics. Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).
- Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. A mathematical model of drug transport in human breast cancer. Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).
- Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions. Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).
- Brown, J. M., Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
