Isolamento di mouse cellule epiteliali delle vie respiratorie ed esposizione al fumo di sigaretta Sperimentale interfaccia Air Liquid
Summary
Le cellule epiteliali polmonari può essere isolato dal tratto respiratorio dei topi e colto in aria-liquido come un modello di differenziazione dell'epitelio respiratorio. Un protocollo è descritto per l'isolamento, la coltura e l'esposizione di queste cellule al fumo di sigaretta tradizionale, al fine di studiare le risposte molecolari di questa tossina ambientale.
Abstract
Le cellule epiteliali polmonari può essere isolato dal tratto respiratorio dei topi e colto in aria-liquido (ALI) come un modello di differenziazione dell'epitelio respiratorio. Un protocollo è descritto per isolare queste cellule e di esporre al fumo di sigaretta mainstream (CS), al fine di studiare le risposte delle cellule epiteliali all'esposizione CS. Il protocollo si compone di tre parti: l'isolamento delle cellule epiteliali delle vie aeree da mouse trachea, la coltura di queste cellule in aria-liquido (ALI) come cellule altamente differenziate epiteliali, e la consegna del tradizionale CS calibrato a queste cellule in coltura. Il sistema di coltura ALI permette la cultura del epiteli delle vie respiratorie, in condizioni che si avvicinano maggiormente a loro ambiente fisiologico rispetto ai sistemi normali coltura liquida. Lo studio delle risposte cellulari e molecolari di esposizione ai polmoni CS è un componente fondamentale di comprendere l'impatto dell'inquinamento atmosferico ambientale sulla salute umana. I risultati della ricerca in questo settore possono in ultima analisi, contribuire alla comprensione della eziologia della malattia polmonare ostruttiva cronica (BPCO), e altre malattie legate al tabacco, che rappresentano gravi problemi di salute globale.
Protocol
Discussion
Il protocollo descrive l'isolamento di mouse cellule epiteliali tracheali è adattato dai protocolli di Lei et al., 1, e altri 2-3 con modifiche. Come con qualsiasi isolamento protocollo descrive cellulare, l'aspetto più critico è quello di evitare la contaminazione da batteri patogeni o fungine mediante rigorose tecniche asettiche. Un secondo passo fondamentale è quello di evitare la contaminazione delle culture di fibroblasti, che possono essere evitati mediante dissezione att…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Emeka Ifedigbo per assistenza tecnica e il Dr. Shivraj Tyagi per la preziosa esperienza. Ringraziamo anche il Centro NeuroDiscovery Harvard per l'assistenza al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un American Heart Association Predoctoral concedere 09PRE2250120 a Hilaire Lam, e le sovvenzioni NIH, R01-HL60234, HL55330-R01, R01-HL079904, assegnato a AMK Choi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
References
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
- Shapiro, S. D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).
