Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / -</sup E - / -</sup Ratos
Summary
Neste vídeo mostramos um protocolo para estabelecer linhagens de células do timo de rato linfoma. Ao seguir este protocolo, conseguimos estabelecer várias células T linhas de Atm-/ – e p53-/ – ratos com linfoma tímico.
Abstract
As linhas celulares são uma ferramenta de pesquisa fundamental que pode reduzir o uso de animais de laboratório em pesquisa. Certas cepas de camundongos geneticamente modificados, tais como ATM – / – e p53 – / – consistentemente desenvolver linfoma tímico no início da vida 1,2, e, portanto, pode servir como uma fonte confiável para a derivação de células T murino linhas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o desenvolvimento do timo murino estabelecida linfoma de células T linhas sem a necessidade de adicionar interleucinas, conforme descrito nos protocolos anteriores 1,3. Tumores foram colhidas de camundongos com idade entre três a seis meses, na primeira indicação de tumores visíveis a partir da observação da postura arqueada, trabalhou preparação respiração, pobres e desperdício em um 1,4 linhagem suscetível. Nós temos estabelecido com sucesso várias linhas de células T usando este protocolo e de estirpes puras e Atm – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 e p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 camundongos. Nós ainda demonstram que mais de 90% do estabelecido população de células T CD3 expressa, CD4 e CD8. Consistente com linhas de células de maneira estável estabelecida, as células-T gerados usando o protocolo presentes foram várias passagens por mais de um ano.
Protocol
Discussion
Neste protocolo, nós fornecemos os procedimentos detalhados para estabelecer murino de células T linhas de dois genótipos diferentes do mouse; Atm – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] p53 e – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Usando esse protocolo, um total de 6 (de 7 tentativas) Atm – / – e três (de 5 tentativas) p53 – / – murino de células T linhas foram estabelecidas em nosso laboratório. Dad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Boris Reizis do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Columbia para discussões úteis. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell e Deequa Mahamed do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Cornell de assistência técnica com citometria de fluxo e Lu Huang para obter ajuda com edição de vídeo. Os autores também desejam agradecer aos membros do Duhamel e laboratórios Weiss para a sua revisão crítica do manuscrito e produção de vídeo, e Stephanie Yazinski do laboratório Weiss para reprodução e genotipagem p53 – / – ratos. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Cornell University Animal Care Institucional e Comitê de uso. Esta pesquisa foi suportada em parte por fundos fornecidos pelo Departamento de Agricultura dos EUA, Pesquisa do Estado de Cooperativa, Educação e Serviço de Extensão da Saúde Animal, e Programa de Pesquisa de Doenças (para GED e RSW) e subvenções NIH R03 HD058220 e R01CA108773 (para RSW). O vídeo foi produzido usando in-house instalações pelo pessoal dos laboratórios Duhamel & Weiss.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
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