Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm - / -</sup Y P53 - / -</sup Ratones

Summary

En este video se demuestra un protocolo para establecer ratón timo líneas celulares de linfoma. Siguiendo este protocolo, hemos establecido con éxito varias líneas de células T de la ATM-/ – y p53-/ – ratones con linfoma del timo.

Abstract

Las líneas celulares establecidas son una herramienta de investigación fundamental que puede reducir el uso de animales de laboratorio en la investigación. Ciertas cepas de ratones genéticamente modificados, tales como ATM ^{– / –} y p53 ^{– / –} consistentemente desarrollar linfoma del timo primeros años de vida ^1,2, y por lo tanto, puede servir como una fuente confiable para la derivación de murino líneas de células T. Aquí presentamos un protocolo detallado para el desarrollo de linfomas tímicos murinos establecido líneas de células T, sin necesidad de añadir las interleucinas como se describe en los protocolos anteriores ^1,3. Los tumores se cosecharon de los ratones de tres a seis meses, en la primera indicación de tumores visibles sobre la base de la observación de la postura encorvada, dificultad para respirar, la preparación pobre y perder en un ^1,4 cepa susceptible. Hemos establecido con éxito varias líneas de células T que utilizan este protocolo y cepas puras de ATM ^{– / –} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² y p53 ^{– / –} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ ratones. Además, demuestran que más del 90% de lo establecido población de células T expresa CD3, CD4 y CD8. De acuerdo con las líneas celulares establecidas de forma estable, las células T generados por el uso del presente Protocolo se han pases para más de un año.

Protocol

1. La disección del tumor Para la disección del tumor, una toalla de papel o paño quirúrgico desechable se coloca en la plataforma de la disección y rociado con etanol al 70%. Los ratones de este protocolo son habitualmente sacrificados con CO 2. Coloque el ratón sacrificados en la plataforma de la disección y el spray ambos lados del animal con etanol. El ratón se mantiene en su lugar en la almohadilla de la disección a través de cuatro o más alfileres inserta a través de las…

Discussion

En este protocolo, se proporcionan procedimientos detallados para establecer murino líneas de células T a partir de dos genotipos diferentes del ratón, ATM ^{– / –} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] y p53 ^{– / –} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . Mediante el uso de este protocolo, un total de 6 (de 7 intentos) ATM ^{– / –} y tres (de 5 intentos) p53 ^{– / –} murino líneas de células T se han establecido en nuestro laborato…

Materials

• Ice bucket
• 70% ethanol
• Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
• Two sets of small sterile scissors and forceps
• Sterile 150 mm² Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
• Sterile 18 gauge needles
• 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
• 10% buffered formalin
• Tissue culture flasks
  • T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
  • T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
• 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
• Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
• Culture medium
  • RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
    • 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
    • 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
    • 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
    • 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
• Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
• Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
  • anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
  • anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
  • anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
• Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
• Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
• 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)