Dérivation des thymique lymphome à cellules T à partir des lignes Atm - / -</sup Et - / -</sup Souris

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons un protocole pour établir la souris des lignées cellulaires de lymphome thymique. En suivant ce protocole, nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T de l'ATM-/ – et p53-/ – ont un lymphome thymique.

Abstract

Des lignées cellulaires établies sont un outil de recherche critique qui peut réduire l'utilisation des animaux de laboratoire dans la recherche. Certaines souches de souris génétiquement modifiées, telles que ATM ^{– / –} et p53 ^{– / –} constamment développer un lymphome thymique tôt dans la vie ^1,2, et donc, peut servir comme une source fiable pour la dérivation de cellules T murines lignes. Nous présentons ici un protocole détaillé pour le développement des établis murin thymique lymphome à cellules T lignes sans avoir besoin d'ajouter les interleukines comme décrit dans les protocoles antérieurs ^1,3. Les tumeurs ont été récoltés à partir des souris âgées de trois à six mois, à la première indication de tumeurs visibles basée sur l'observation d'une posture voûtée, respiration laborieuse, le toilettage pauvres et gaspiller dans une souche sensible ^1,4. Nous avons établi avec succès plusieurs lignées de lymphocytes T en utilisant ce protocole et de souches pures de l'ATM ^{– / –} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² et p53 ^{– / –} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ souris. Nous avons également démontré que plus de 90% de la place des cellules T CD3 population exprime, CD4 et CD8. Conformément aux lignées cellulaires établies de façon stable, les cellules T générées par l'utilisation du présent protocole ont été repiquées pendant plus d'un an.

Protocol

1. La dissection de la tumeur Pour la dissection tumorale, une serviette en papier propre ou jetable drap chirurgical est placé sur le pavé de dissection et pulvérisé avec de l'éthanol à 70%. Souris pour ce protocole sont systématiquement euthanasiés avec du CO 2. Placez la souris euthanasiées sur le pavé de dissection et de pulvérisation des deux côtés de l'animal avec de l'éthanol. La souris est maintenu en place sur le pad de dissection en utilisant quatre ou …

Discussion

Dans ce protocole, nous fournir des procédures détaillées pour établir murin lignées de lymphocytes T à partir de deux génotypes différents de souris; ATM ^{– / –} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] et p53 ^{– / –} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . En utilisant ce protocole, un total de 6 (sur 7 tentatives) ATM ^{– / –} et trois (sur 5 tentatives) p53 ^{– / –} murins lignées de lymphocytes T ont été établis dans notre…

Materials

• Ice bucket
• 70% ethanol
• Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
• Two sets of small sterile scissors and forceps
• Sterile 150 mm² Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
• Sterile 18 gauge needles
• 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
• 10% buffered formalin
• Tissue culture flasks
  • T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
  • T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
• 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
• Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
• Culture medium
  • RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
    • 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
    • 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
    • 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
    • 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
• Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
• Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
  • anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
  • anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
  • anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
• Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
• Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
• 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)