גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים
Summary
בסרטון הזה אנחנו מדגימים את פרוטוקול להקים הרתי עכבר לימפומה שורות תאים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, הקמנו בהצלחה מספר T-cell קווי ATM-/ – ו-p53-/ – עכברים עם לימפומה הרתי.
Abstract
שורות תאים הוקמה הם כלי מחקר ביקורתי זה יכול להפחית את השימוש בחיות מעבדה במחקר. זנים מסוימים של עכברים מהונדסים גנטית, כמו כספומט – / – ו-p53 – / – בעקביות לפתח לימפומה הרתי מוקדם בחיים 1,2, וכך, יכול לשמש מקור אמין עבור הגזירה של T-cell קווי Murine. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לפיתוח הוקמה Murine T-cell קווי הרתי לימפומה ללא צורך להוסיף אינטרלויקינים כפי שמתואר בפרוטוקולים הקודמים 1,3. גידולים נבצרו מעכברים בגילאי שלושה עד שישה חודשים, על פי סימן מוקדם של גידולים גלוי מבוססת על התצפית של יציבה כפופה, עמל, נשימה הטיפוח עני מבזבז ב 1,4 זן רגיש. הקמנו בהצלחה מספר T-cell קווי באמצעות פרוטוקול זנים טהורים של ATM – / – [FVB/N- כספומט tm1Led / J] 2 ו – p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 עכברים. בנוסף, אנו מראים כי יותר מ -90% מהאוכלוסייה T-cell הוקמה מבטא CD3, CD4 ו – CD8. בהתאם שורות תאים הוקמה ביציבות, ה-T לתאים שנוצר באמצעות פרוטוקול הנוכחי כבר passaged במשך למעלה משנה.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מספקים נהלים מפורט להקמת Murine T-cell הקווים משני גנוטיפים עכבר שונים; כספומט – / – [FVB/N- כספומט tm1Led / J] ו – p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . באמצעות פרוטוקול זה, סך של 6 (מתוך 7 ניסיונות) כספומט – / – ושלושה (מתוך 5 ניסיונ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר בוריס Reizis מהמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה לדיונים מועילים. כמו כן, אנו מבקשים להודות ד"ר מרגרט Bynoe, ד"ר רודמן Getchell ו Deequa Mahamed מהמחלקה למיקרוביולוגיה ולאימונולוגיה במכללה לרפואה וטרינרית באוניברסיטת קורנל לקבלת סיוע טכני עם cytometry זרימה הואנג לו סיוע עם עריכת וידאו. המחברים גם רוצה להודות לחברי דוהמל ו וייס מעבדות לבדיקה ביקורתית הייצור שלהם כתב היד הוידאו, וסטפני Yazinski מן המעבדה וייס הרבייה genotyping p53 – / – עכברים. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קורנל מוסדיים ועדת שימוש. מחקר זה מומן בחלקו על ידי קרנות הניתנים על ידי משרד החקלאות האמריקני, מחקר שיתופית המדינה, החינוך, שירות ההדרכה והמקצוע, בריאות בעלי חיים ועל תוכנית המחקר מחלות (עד GED ו RSW) ו-NIH מענקים R03 HD058220 ו R01CA108773 (עד RSW). הסרטון הופק באמצעות in-house מתקני ידי אנשי ממעבדות דוהמל & וייס.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
- Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
- Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
- Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
- Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).
