Thymic लिंफोमा से टी सेल लाइन्स की व्युत्पत्ति एटीएम / -</sup और P53 / -</sup चूहे
Summary
इस वीडियो में हम एक प्रोटोकॉल के लिए माउस thymic लिंफोमा सेल लाइनों की स्थापना प्रदर्शित करता है. और p53 / – thymic लिंफोमा के साथ चूहों इस प्रोटोकॉल का अनुसरण करके, हम सफलतापूर्वक एटीएम / से कई टी सेल लाइनों की स्थापना की है.
Abstract
स्थापित सेल लाइनों एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण है कि अनुसंधान में प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग को कम कर सकते हैं. , जैसे एटीएम आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के कुछ उपभेदों – / – और p53 – / – लगातार thymic लिंफोमा 1,2 जीवन में जल्दी विकसित करने, और इस प्रकार, murine टी सेल लाइनों की व्युत्पत्ति के लिए एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में सेवा कर सकते हैं. यहाँ हम के रूप में पिछले 1,3 प्रोटोकॉल में वर्णित interleukins जोड़ने की जरूरत के बिना में स्थापित murine thymic लिंफोमा टी सेल लाइनों के विकास के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. ट्यूमर तीन से छह महीने के आयु वर्ग के चूहों से काटा गया, hunched मुद्रा के अवलोकन के आधार पर दिखाई ट्यूमर के जल्द से जल्द संकेत पर, श्वास, गरीब संवारने और एक अतिसंवेदनशील तनाव 1,4 में बर्बाद कर अस्वाभाविक. / – – [FVB/N- एटीएम tm1Led / जम्मू] 2 और p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / जम्मू] 5 चूहों हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कई टी सेल लाइनों और एटीएम की जन्मजात उपभेदों की स्थापना की है. हम आगे दिखाना है कि टी सेल स्थापित जनसंख्या के 90% से अधिक CD3 सीडी 4, और CD8 व्यक्त. लगातार stably स्थापित सेल लाइनों के साथ, वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न टी कोशिकाओं को एक वर्ष से अधिक के लिए किया गया passaged है.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम दो अलग माउस जीनोटाइप से murine टी सेल लाइनों की स्थापना, एटीएम / – [FVB/N- एटीएम tm1Led / जम्मू] और p53 – / के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं प्रदान करते हैं – [129/S6- Trp53 / tm1Tyj जम्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Dr. Boris Reizis from the Department of Microbiology and Immunology at Columbia University for helpful discussions. We also wish to thank Dr. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell and Deequa Mahamed from the Department of Microbiology and Immunology at the College of Veterinary Medicine, Cornell University for technical assistance with flow cytometry and Lu Huang for assistance with video editing. The authors also wish to thank the members of Duhamel and Weiss laboratories for their critical review of the manuscript and video production, and Stephanie Yazinski from the Weiss laboratory for breeding and genotyping p53-/- mice. Experiments on animals were performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee. This research was supported in part by funds provided by the US Department of Agriculture, Cooperative State Research, Education, and Extension Service, Animal Health and Disease Research Program (to G.E.D. and R.S.W.) and NIH grants R03 HD058220 and R01CA108773 (to R.S.W). The video was produced using in-house facilities by the personnel from the Duhamel & Weiss laboratories.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
- Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
- Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
- Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
- Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).
