에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup과 p53의 - / -</sup 마우스

Summary

이 비디오에서는 마우스 thymic 림프종 세포 라인을 확립 프로토콜을 보여줍니다. 및 p53의 – / – – thymic 림프종과 생쥐이 프로토콜에 따라, 우리는 성공적으로 여러 ATM – /에서 T – 세포 라인을 설립했습니다.

Abstract

설립 세포 라인은 연구 실험 동물의 사용을 줄일 수있는 중요한 연구 도구입니다. 특정 같은 ATM과 같은 유전자 변형 생쥐의 변종 ^{– / -와} p53의 ^{– /이 –} 일관되게 일찍 삶 ^1,2에서 thymic 림프종을 개발하고, 따라서, murine T – 세포 라인의 유도를위한 신뢰할 수있는 소스로 검색할 수 있습니다. 여기는 이전의 프로토콜 ^1,3에서 설명한 interleukins를 추가할 필요없이 설립 murine thymic T – 세포 림프종 라인의 개발을위한 세부적인 프로토콜을 제시한다. 종양은 hunched 자세의 관찰을 바탕으로 눈에 보이는 종양의 초기 표시에서 3~6개월 세 생쥐에서 수확 호흡, 가난한 정리하고 민감한 스트레인 ^1,4의 낭비를 보람 있었다. ^{/ – –} [FVB/N- ATM ^tm1Led / J] ² p53의 ^{– / –} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ 쥐가 우리는 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 여러 개의 T – 세포 라인과 ATM의 근친 변종을 설립했습니다. 우리는 더 이상 기존 T – 세포 인구의 90 % 이상이 인 경우에는 3 번 CD, CD4와 CD8을 표현 것을 보여줍니다. 안정 설립 세포 라인과 일치, 현재 프로토콜을 사용하여 발생하는 T – 세포는 일년 이상 passaged되었습니다.

Protocol

1. 종양의 해부 종양 절개 들어, 깨끗한 종이 타월이나 일회용 외과 드레이프는 해부 패드에 위치하고 있으며 70 %의 에탄올로 뿌렸어요. 이 프로토콜에 대한 생쥐가 일상적으로 CO 2 euthanized 있습니다. 절개 패드에 euthanized 마우스를 놓고 에탄올과 동물의 양쪽을 스프레이. 마우스는 다리를 통해 삽입 70 % 에탄올로 철저하게 뿌려놓은 4 개 이상의 푸시 핀을 사용하여 절개 패?…

Discussion

이 프로토콜에서는, 우리는 두 개의 다른 마우스 genotypes에서 murine T – 세포 라인을 확립하기위한 자세한 절차를 제공한다 ^{– / –} [FVB/N- ATM ^tm1Led / J]와 p53의 ^{– / –} ATM [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . ^{/ – –} 세 (5 시도 아웃) p53의 ^{– / -이} 프로토콜, 6 총 (7 시도 아웃) ATM을 사용하여 murine T – 세포 라인은 우리 연구실에서 설…

Materials

• Ice bucket
• 70% ethanol
• Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
• Two sets of small sterile scissors and forceps
• Sterile 150 mm² Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
• Sterile 18 gauge needles
• 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
• 10% buffered formalin
• Tissue culture flasks
  • T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
  • T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
• 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
• Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
• Culture medium
  • RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
    • 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
    • 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
    • 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
    • 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
• Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
• Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
  • anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
  • anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
  • anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
• Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
• Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
• 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)