تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب
Summary
هذه المقالة تفاصيل الإجراءات المتعلقة overexpression وتحليل GTPases صغيرة في الخلايا الظهارية الاستقطاب باستخدام تقنية microinjection.
Abstract
الخلايا الظهارية استقطاب غشاء البلازما الخاصة بهم في كيميائيا ومتميزة وظيفيا المجالات قمية وbasolateral حيث المجال قمية يواجه 'الحرة' السطوح والغشاء basolateral على اتصال مع الركيزة والخلايا المجاورة. ويفصل غشاء كلا المجالات التي منعطفات ضيقة ، والتي تشكل حاجزا نشرها. ويمكن تلخيصها قمية – basolateral بنجاح في ثقافة الاستقطاب عند المصنف الخلايا الظهارية مثل الكلى الناب مدين – داربي (MDCK) في الخلايا على مرشحات عالية الكثافة والبولي ومثقف لعدة أيام 1 2. وينظم إنشاء وصيانة قطبية الخلية من قبل مجموعة من GTPases صغير من الفصيلة مثل رأس رالا ، Cdc42 ، Rab8 ، وRab10 Rab13 3 4 5 6 7. مثل كل GTPases هذه البروتينات دورة الناتج المحلي الإجمالي بين دولة محددة نشط وفعال دولة GTP محدد. طفرات معينة في مناطق الربط النوكليوتيدات تتداخل مع هذه الدراجات 8. على سبيل المثال ، يتم تأمين دائم Rab13T22N في شكل الناتج المحلي الإجمالي ، وبالتالي يطلق عليها اسم "المهيمن السلبية" ، في حين لم تعد قادرة على Rab13Q67L يتحلل GTP ومؤمن وبالتالي في حالة "نشطة المهيمنة' 7. لتحليل وظيفتها في الخلايا عادة يتم التعبير عن كل من الأليلات السائدة السلبية والنشطة GTPases المهيمن على مستويات عالية للتدخل في وظيفة من البروتينات الذاتية 9. طريقة أنيقة لتحقيق مستويات عالية من overexpression في فترة قصيرة من الوقت هي لتعريف البلازميدات ترميز البروتينات ذات الصلة مباشرة في نوى خلايا الاستقطاب نمت على تصفية تدعم استخدام تقنية microinjection. غالبا ما يتم الجمع بين هذا مع الحقن المشترك للالبلازميدات مراسل تكود مستقبلات غشاء البلازما التي يتم فرزها على وجه التحديد إلى المجال أو قمية basolateral. وكثيرا ما تستخدم لشحن البضائع تحليل الفرز إلى المجال basolateral هو أليل درجة الحرارة حساسة من فيروس التهاب الفم الحويصلي بروتين سكري (VSVGts045) 10. لا يمكن لهذا البروتين بشكل صحيح في حظيرة 39 درجة مئوية ، وبالتالي فسيتم الاحتفاظ بها في شبكية هيولي باطني (ER) ، في حين يتم تجميع البروتين التنظيمية للمصلحة في العصارة الخلوية. التحول إلى 31 درجة مئوية وسوف يسمح لأمثال ثم VSVGts045 بشكل صحيح ، وترك لائحة والسفر إلى غشاء البلازما 11. عادة ما يتم تنفيذ هذه المطاردة في حضور سيكلوهيكسيميد لمنع المزيد من تخليق البروتين يؤدي إلى نتائج أكثر نظافة. نحن هنا تصف بالتفصيل إجراءات microinjecting البلازميدات الى خلايا الاستقطاب وحضانات التحولات اللاحقة بما في ذلك درجة الحرارة التي تسمح لتحليل شامل من البروتينات التنظيمية المشاركة في الفرز basolateral.
Protocol
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لتجربة microinjection الناجحة هي جودة ونقاء من الحمض النووي والتقاطب من الخلايا الخاصة بك. بدون خلايا الاستقطاب ، وسوف تسيطر بالفعل الخاص حقن وmistargeted VSVG ولا يمكن استخدامها لتكون التجربة. إذا كان الحمض النووي هو من نوعية رديئة ، قد دنا تسد إبرة ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (GM070736) لحاء Fölsch. كان مدعوما من قبل SF آنغ A STAR * الجائزة منحة دراسية عليا ، وكان مدعوما من قبل RS كانغ أساس الخلوية والجزيئية لبرنامج التدريب على الأمراض (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Mellman, I., Nelson, W. J. . Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. . Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. . The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. . Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. . Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. . Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).
- Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. . The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).
- Collins, R. N. Molecular cell. 12, 1064-1064 (2003).
- Hall, A. . Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).
- Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. . Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).
- Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. . Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).
