Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate
Summary
Questo articolo precisa le procedure necessarie per l'iperespressione e l'analisi delle piccole GTPasi in cellule epiteliali polarizzate usando la tecnica microiniezione.
Abstract
Le cellule epiteliali polarizzare la loro membrana plasmatica in domini apicale e basolaterale biochimicamente e funzionalmente distinti in cui il dominio apicale si affaccia sul 'libero' delle superfici e la membrana basolaterale è in contatto con il substrato e le cellule vicine. Entrambi i domini di membrana sono separati da giunzioni strette, che formano una barriera alla diffusione. Apicale-basolaterale polarizzazione può essere riassunta con successo in coltura quando le cellule epiteliali, come Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sono teste di serie ad alta densità su filtri in policarbonato e coltivate per diversi giorni 1 2. Creazione e mantenimento di polarità delle cellule è regolata da una serie di piccole GTPasi della superfamiglia Ras come Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 3 4 5 6 7. Come tutte le GTPasi queste proteine ciclo tra un inattivo PIL legato Stato e un attivo GTP-bound stato. Specifiche mutazioni nelle regioni nucleotide binding interferire con questo ciclismo 8. Per esempio, Rab13T22N è permanentemente bloccato nella forma del PIL e quindi soprannominato 'dominante negativo', mentre Rab13Q67L non può più idrolizzare GTP e quindi è bloccata in uno stato 'dominante attivo' 7. Per analizzare la loro funzione nelle cellule entrambi gli alleli dominanti negativi e dominante attiva della GTPasi sono tipicamente espressa ad alti livelli di interferire con la funzione delle proteine endogene 9. Un modo elegante per raggiungere elevati livelli di overespressione in un breve lasso di tempo è quello di introdurre i plasmidi codifica le proteine pertinenti direttamente nei nuclei delle cellule coltivate su filtro polarizzato supporta l'utilizzo di tecnica microiniezione. Questo è spesso combinata con la co-iniezione di plasmidi reporter che codificano recettori di membrana plasmatica che sono specificamente ordinati al dominio apicale o basolaterale. Un carico di frequente utilizzato per analizzare carico ordinamento al dominio basolaterale è un allele sensibile alla temperatura del virus della stomatite vescicolare glicoproteina (VSVGts045) 10. Questa proteina non può piegare correttamente a 39 ° C e sarà quindi mantenuto nel reticolo endoplasmatico (ER), mentre la proteina regolatrice di interesse è assemblata nel citosol. Uno spostamento a 31 ° C, quindi consentire VSVGts045 piegare correttamente, lasciare il Pronto Soccorso e viaggiare alla membrana plasmatica 11. Questa caccia viene di solito effettuata in presenza di cicloesimide per evitare ulteriori sintesi proteica che porta a ottenere risultati più nitidi. Qui si descrivono in dettaglio la procedura di microinjecting plasmidi in cellule polarizzate e successive incubazioni compresi turni di temperatura che permettono una analisi completa delle proteine regolatrici coinvolte nella selezione basolaterale.
Protocol
Discussion
Le fasi più critiche per un esperimento di microiniezione di successo sono la qualità e la purezza del DNA e la polarità delle cellule. Senza cellule polarizzate, il controllo iniezione sarà già mistargeted VSVG e l'esperimento non può essere utilizzato. Se il DNA è di scarsa qualità, il DNA può intasare l'ago dell'iniezione porta a scarsa o assente espressione della proteina desiderata a tutti. Inoltre, è consigliabile utilizzare i plasmidi di espressione che sono conosciuti per portare a livelli …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (GM070736) a H. Fölsch. SF Ang è stato sostenuto da una borsa di studio * Un premio STAR Graduate, e RS Kang è stata sostenuta dalla basi cellulari e molecolari della malattia programma di formazione (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
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