Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées
Summary
Cet article détaille les procédures impliquées dans la surexpression et l'analyse des petites GTPases dans les cellules épithéliales polarisées en utilisant la technique de microinjection.
Abstract
Les cellules épithéliales polarisent leur membrane plasmatique dans biochimiquement et fonctionnellement distinctes domaines apical et basolatéral où le domaine apical face à la «libre» des surfaces et la membrane basolatérale est en contact avec le substrat et les cellules voisines. Les deux domaines membranaires sont séparés par des jonctions serrées, qui forment une barrière de diffusion. Apicale-basolatérale polarisation peut être récapitulé avec succès dans la culture lorsque les cellules épithéliales rénales canines telles que Madin-Darby (MDCK) sont ensemencées à haute densité sur des filtres de polycarbonate et cultivées pendant plusieurs jours 1 2. Création et maintien de la polarité cellulaire est régulée par un ensemble de petites GTPases de la superfamille Ras, comme RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 et Rab13 3 4 5 6 7. Comme tous ces protéines GTPases cycle entre une inactifs PIB lié état et un actif lié au GTP Etat. Des mutations spécifiques dans les régions de fixation du nucléotide interférer avec ce vélo 8. Par exemple, Rab13T22N est définitivement verrouillée dans le PIB-forme et donc surnommé «dominant négatif», alors que Rab13Q67L ne peut plus hydrolyser le GTP et est donc bloqué dans un état «dominante active» 7. Afin d'analyser leur fonction dans les cellules à la fois dominante et dominante négative allèles active de GTPases sont habituellement exprimés à des niveaux élevés d'interférer avec la fonction des protéines endogènes 9. Une manière élégante d'atteindre des niveaux élevés de la surexpression dans un court laps de temps est d'introduire les plasmides codant pour les protéines pertinentes directement dans les noyaux des cellules polarisées cultivées sur filtre prend en charge en utilisant la technique de microinjection. Ceci est souvent combiné avec la co-injection de plasmides qui codent les récepteurs journaliste de la membrane plasmique qui sont spécifiquement triés sur le domaine apical ou basolatéral. Une cargaison fréquemment utilisés pour analyser les cargaisons de tri pour le domaine basolatéral est un allèle thermosensible de la glycoprotéine du virus de stomatite vésiculaire (VSVGts045) 10. Cette protéine ne peut pas se replier correctement à 39 ° C et sera donc retenue dans le réticulum endoplasmique (RE), alors que la protéine de régulation d'intérêt est assemblé dans le cytosol. Le passage à 31 ° C permettra alors de plier VSVGts045 correctement, laisser la salle d'urgence et de voyage à la membrane plasmique 11. Cette chasse est généralement effectuée en présence de cycloheximide pour empêcher la synthèse des protéines supplémentaires menant à l'assainissement de résultats. Ici nous décrivons en détail la procédure de micro-injection des plasmides dans les cellules polarisées et incubations ultérieures, y compris les changements de température qui permettent une analyse complète des protéines de régulation impliqués dans le tri basolatérale.
Protocol
Discussion
Les étapes les plus critiques pour une expérience réussie de microinjection sont la qualité et la pureté de l'ADN et la polarité de vos cellules. Sans cellules polarisées, votre commande d'injection aura déjà mistargeted VSVG et l'expérience ne peut pas être utilisé. Si l'ADN est de mauvaise qualité, l'ADN peut obstruer l'aiguille d'injection entraînant peu ou pas d'expression de la protéine désirée du tout. Aussi, il est conseillé d'utiliser des plasmides d'expr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une subvention des National Institutes of Health (GM070736) à H. Fölsch. SF Ang a été soutenue par un prix A * STAR bourses d'études supérieures, et RS Kang a été soutenue par la base cellulaire et moléculaire du programme de formation des maladies (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
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