Summary
هذا البروتوكول يصف أسلوب الإنتاجية العالية من الإنزيمية التي تستخدم قارئ microplate لقياس وتصنيف التربة والفوسفور monoesters ف ، ف diesters وغير العضوية P. يصل الى 96 عينات يمكن قياسها في وقت واحد في المختبر القياسية.
Abstract
أنواع كثيرة من الجزيئات العضوية (P) الفسفور الموجودة في العينات البيئية 1. القياسات التقليدية ف عدم الكشف عن هذه المركبات العضوية ف نظرا لأنها لا تتفاعل مع الكواشف اللونية 2،3. الإنزيمية (EH) هي طريقة لوصف بدقة الناشئة أشكال ف العضوية في العينات البيئية 4،5. غير ملفقة فقط هذا الأسلوب في دقة الفوسفور - 31 بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR 31 ف) ، وهو الأسلوب الذي هو مكلف ويتطلب training6 التقنية المتخصصة. وقد تكيفت نحن أسلوب الإنزيمية قادرة على قياس ثلاث فئات من الفوسفور (P monoester ، ف ف diester وغير العضوية) إلى نظام القارئ microplate 7. هذا الأسلوب يتيح للباحثين وسيلة سريعة ودقيقة ، وبأسعار معقولة وسهلة الاستخدام لقياس ف الأنواع في التربة والرواسب والأسمدة ، وإذا ركزت والعينات المائية. هذا هو الأسلوب الوحيد الإنتاجية العالية لقياس أشكال وانزيم lability - P من العضوية التي يمكن القيام بها في مختبر القياسية. البيانات الناتجة يقدم رؤية للعلماء الذين يدرسون محتوى النظام الغذائي واحتمال التخثث.
Protocol
1. استخراج الفوسفور
- يعد حل 1L من هيدروكسيد الصوديوم 0.25 M (هيدروكسيد الصوديوم ، 40.00 جم / مول) 0.05 + حمض Ethylenediaminetetraacetic M (EDTA ، 292.24 جم / مول).
- إضافة 30 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم EDTA + إلى 2 غرام من التربة الرطبة أو المجففة / عينة في أنبوب مخروطي 50 مل.
- احتضان مع الانفعالات لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي 3000 x ج لمدة 3 دقائق.
2. تعديل عينة استخراج الرقم الهيدروجيني
- نقل قسامة مل من 0.1 إلى 1.5 أنبوب الطرد المركزي مل الصغرى.
- إضافة 0.017 مل من حامض الخليك 2.5 M ، 0.144 مل من 0.4 العازلة خلات M (70.5 ٪ من خلات الصوديوم [CH 3 COONa ، 82.03 جم / مول] و 29.5 ٪ من حامض الخليك ، ودرجة الحموضة 5.0) ، و0.739 مل من الماء منزوع الأيونات.
- والحجم النهائي للتعديل يمكن استخراج 1 مل والنهائي سيكون الرقم الهيدروجيني 5.0.
3. تحضير الانزيم ألبوم الحل
- تحضير 1 لتر من 0.1 خلات الصوديوم M (CH 3 COONa ، 82.03 جم / مول) حل ، ودرجة الحموضة 5.0.
- تحضير حامض 2 × 10 مل حلول الأسهم الفوسفاتيز في خلات الصوديوم العازلة أعد في مثل هذه الخطوة أن تركيزات 3.1 النهائية لكل وحدات 0.5 / مل.
حمض الفوسفاتيز النوع الأول من aestivum الحنطة (القمح الجرثومية ؛ GP ، عموما 0،5 ملغ U - 1 الصلبة ، EC 3.1.3.2)
حمض الفوسفاتيز النوع الرابع من الحدبي - S مغد (البطاطا ؛ PP ، وعموما 4،6 ملغ U - 1 الصلبة ، EC 3.1.3.2)
* يتم تحديد وحدات من النشاط الذي يقوم به تجار حيث يتم تعريف 1 وحدة وتحرير micromole 1 من الفوسفاتية في حل لكل ساعة عند 37 درجة مئوية. - إعادة مجفد nuclease P1 (EC 3.1.30.1) من citrinum البنسليوم (الفطريات ؛ NP1 ، وعموما 500 ملغ يو -1 الصلبة) في واحد مل من الماء منزوع الأيونات هذا ويمكن الآن أن يتم تخزين في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- ماصة NP1 إلى واحد من أنابيب 10 مل أعد في خطوة 3.2 من هذا القبيل أن التركيز النهائي هو 2.5 وحدة / مل NP1 ؛ المزيج بلطف عدة مرات عكس.
- الطرد المركزي وهما الانزيم 10 مل حلول 3000 x ج لمدة 30 دقيقة.
4. ف منحنى المعايرة والتحكم
- تحضير 1 لتر من 1 ملم فوسفات البوتاسيوم (K2HPO4 ، 174.18 جم / مول) محلول المخزون.
- إضافة 1 مل من 1 ملم فوسفات البوتاسيوم محلول المخزون إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وأداء seven 0.5 مل التخفيفات المتسلسلة.
- تجاهل الأنبوب الأول بحيث يكون لديك 7 التخفيفات تتراوح بين 20 nmol - 0.625 nmol P.
- نقل 80 ميكرولتر من كل أنبوب في صفوف مكررة إلى B -- H من لوحة قياسية 96 - جيدا.
- إضافة 80 ميكرولتر من العازلة خلات الصوديوم (القسم 3.1) إلى صف من الأعمدة 11 و 12 ، وهذا هو معايرة ف 0 nmol نقطة.
- كل عمود 11 و 12 يحتوي الآن على عينات مرجعية من 8 إلى 0 nmol الفوسفات غير العضوية 20 nmol.
- وسوف تحتوي على 10 عمود للضوابط التالية :
- إضافة 40μL PP انزيم GP + الحل + 40 خلات الصوديوم ميكرولتر العازلة (القسم 3.1) إلى الآبار الثلاث الأولى في العمود 10.
- إضافة 40 ميكرولتر PP + + GP حل انزيم NP1 + 40 خلات الصوديوم ميكرولتر العازلة إلى الآبار الثلاث المقبلة.
- إضافة 40 خلات الصوديوم محلول يحتوي على 10 ميكرولتر الجلوكوز 6 فوسفات nmol (C 6 H 11 O 2 نا 9 ف &bullet؛ XH 2 O ، 304.1 غرام / مول) + 40 ميكرولتر PP انزيم GP + حل لبئر واحدة لخير النهائي الحل في العمود إضافة 10 خلات الصوديوم بدلا من حل الانزيم.
5. + عينة انزيم الحضانة
- وسوف يتم اختبار كل عينة احتلال أول 9 آبار في الصف 1 من لوحة قياسية 96 - جيدا.
- توزيع 40 ميكرولتر مقتطفات عينة الرقم الهيدروجيني المعدل من 2 إلى القسم 1-9 في الآبار يصل إلى 8 صفوف.
- بعد أن تم توزيع جميع العينات * استخدام ماصة الأقنية لتوزيع PP انزيم GP + حل لأعمدة 1-3 ، PP + + GP NP1 إلى أعمدة 4-6 والصوديوم العازلة خلات (المعد في القسم 3.1) إلى الأعمدة 7-9.
* يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل سريع لضمان الحصول على جميع العينات يعادل فترة حضانة. - تغطية لوحة 96 - جيدا مع غطاء وعينات احتضان + حلول الانزيم والضوابط ومنحنى المعايرة بالضبط 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
6. اللونية قياس الاصدار و ف الخلفية غير عضوي
- تحضير 50 مل من كل من الحلول التالية في الماء منزوع الأيونات :
* الحل : 0.1 حمض الاسكوربيك M (C6H8O6 ، 176.12 جم / مول) + حمض حمض التريكلوروسيتيك 0.5M (Cl3CCOOH ، 163.39 جم / مول)
حل باء : 0.01 موليبدات الأمونيوم M ((NH4) 2MoO4 ، 196.01 جم / مول)
الحل C : 0.1 سيترات الصوديوم M (المخصص (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O ، 294.10 جم / مول) + 0.2 زرنيخات الصوديوم M (NaAsO2 ، 129.91 جم / مول) + 5 ٪ حمض الخليك الجليدية
(CH3CO2H ، 60.05 جم / مول) * الحل يجب أن يكون مستعدا واليومية. - إضافة 25 ميكرولتر من محلول SDS ، 100 ميكرولتر من محلول A ، B 20 ميكرولتر من الحل وميكرولتر 50 و جيم حلول لجميع الآبار في رر 96 - جيداأكلت. القيام بذلك بسرعة مع ماصة الأقنية.
- تغطية لوحة واحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قياس الامتصاصية في 850 نانومتر في أي قارئ لوحة صغيرة الانضباطي.
7. تصنيف المركبات P
- استيراد البيانات الخام إلى تطبيق جدول بيانات (مثل Microsoft Excel).
- رسم منحنى المعايرة الفوسفور غير العضوي : 0-40 nmol P على المحور x ويعني قياسات الامتصاصية مكررة على محور ذ.
- إجراء الانحدار الخطي وايجاد معادلة خط أفضل مناسبا.
- الأعمدة 1-3 : تطبق مباشرة على منحنى المعايرة هذه هي الخلفية P. اللاعضوية
- الأعمدة 4-6 : متوسط قيم العينة وطرح ثلاث نسخ من الضوابط (حل الانزيم + P الخلفية غير عضوية) من إجمالي الامتصاصية ، هذا هو مستمد من monoesters ف ف hydrolysable.
- الأعمدة 7-9 : نفس 7.5 باستثناء القيم الامتصاصية طرح من أعمدة 4-6 -- وهذا هو من diesters ف ف hydrolysable.
- تحويل البيانات إلى ف الامتصاصية nmol أفرج عن طريق تطبيق معادلة المعايرة.
- صدر nmol ف يمكن أن ترتبط العودة إلى ف مغ / كغ من التربة الأصلية. بدلا من ذلك ، قد نسب تقييم كل فئة P أيضا أن يكون نهجا مفيدا لتحليل البيانات.
8. ممثل النتائج :
وهناك تفتيش سريعة البصرية لوحة 96 - جيدا بعد الكيمياء اللونية تقديم أدلة على ما إذا كانت أو لم تكن تنفيذ الإجراء بشكل صحيح. أول شيء هو للتحقق من مستوى السائل في كل بئر عن طريق مسح الجانبي للوحة. يجب أن يكون هناك بالضبط 275 ميكرولتر من الكواشف في جميع الآبار. المقبل ، وفحص البصر لون عينة من الآبار ثلاث نسخ مكررة والآبار المعايرة. وينبغي تكرار هذه التقنية يكون الظل نفسه من اللون الأزرق. تطبيق المقبل منحنى المعايرة للبئرين تحتوي على الجلوكوز 6 فوسفات والتحقق من أنها أفرجت عن 10 من nmol P. غير العضوية وبعد استخراج مجموع P تم قياسها باستخدام ICP - OES أو أسلوب بديل ، تأكد من القيم المحسوبة ف مجموع باستخدام هذه البروتوكول لا تتجاوز مبلغ ف التي تم استخراجها.
ملاحظة : الدقيق وإدارة البيانات في جدول وسوف يساعد في الوقاية من أخطاء الكمي. هل سيتم التعامل مع الكثير من الأرقام دفعة واحدة ، وبالتالي تهيئة قالب يكون الوقت جيدا المستهلك.
الشكل 1. صفيحة 96 - جيدا تظهر نتائج العينات لمدة 8 (صفوف ه) ومنحنى المعايرة (أعمدة 11 و 12). الضوابط هي في العمود 10. زيادة كثافة اللون بين الأعمدة 1-3 و 4-6 ومن المقرر أن تحلل مركبات ف monoester ، بين الأعمدة 4-6 و 7-9 ومن المقرر أن تحلل مركبات diester ف.
الشكل 2 : توزيع الطبقات ف في هيدروكسيد الصوديوم 0.25 M - M EDTA 0.05 استخراج عينة التربة باستخدام فيرمونت عالية الإنتاجية الإنزيمية. أشرطة الخطأ تشير قيمة الانحراف المعياري ، 3 = ن.
Discussion
بحكم طبيعتها ، وهي طريقة سريعة باستخدام كميات صغيرة يتطلب عناية كبيرة. لذا فإن أهم الخطوات هي تلك التي تنطوي على حلول pipetting على طبق. دقيقة ، والأهم من ذلك ، تقنية ماصة متسقة ضرورية لنجاح هذا الاختبار.
سيتم استخراج هيدروكسيد الصوديوم EDTA - تسمح تتميز معظم ف في كثير من العينات الى ثلاث فئات : الفوسفاتية ، ف monoester وdiester التربة P. ، الأسمدة ، والرواسب أو أي عينة البيئية الأخرى التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم ، EDTA - استخراجها يمكن وصفها ف . أشكال ف في العينات البيئية ليست مستقرة بالضرورة وهذا الأسلوب يضمن تتميز عينات قبل أن يتم المساس العينات دون الحاجة إلى توظيف جيش من الباحثين.
هذا الاختبار هو مناسبة خاصة عندما يكون عدد كبير من العينات التي سيتم تجهيزها. لقد تم تحجيم احتياجات ومتطلبات كاشف الفضاء وصولا الى مستوى يمكن السيطرة عليه (على سبيل المثال microcentrifuge 1.5 مل أنابيب بدلا من قوارير الزجاج 50 مل). هذا التكيف يحد أيضا من إنتاج النفايات.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر هيئة المسح الجيولوجي والموارد المائية وبحيرة فيرمونت مركز الدراسات لتوفير التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
