Die Sequenzierung der bakteriellen Mikroflora im peripheren Blut: Unsere Erfahrung mit HIV-infizierten Patienten
Summary
Unser Experiment zeigt, wie eine Sequenzierung von bakteriellen Spezies translozierenden im peripheren Blut von HIV-positiven Patienten.
Abstract
Der gesunde Magen-Darm-Trakt ist physiologisch kolonisierten durch eine Vielzahl von kommensalen Mikroben, die die Entwicklung der humoralen und zellulären mukosalen Immunsystems 1,2 beeinflussen.
Microbiota vom Immunsystem über eine starke Schleimhaut-Barriere abgeschirmt. Infektionen und Antibiotika sind dafür bekannt, sowohl die normale Magen-Darm-Schranke und die Zusammensetzung der ansässigen Bakterien, die in möglichst immun Anomalien Ergebnis 3. Mai zu ändern.
HIV verursacht einen Bruch in der Magen-Darm-Barriere mit progressiven Versagen der Schleimhaut-Immunität und Leckagen in die systemische Zirkulation von bakteriellen Bioprodukte, wie Lipopolysaccharid und bakterielle DNA-Fragmente, die zu systemischen Immunaktivierung 4-7 beitragen. Mikrobielle Translokation ist in HIV / AIDS-Immunpathogenese und Ansprechen auf die Therapie 4,8 gebracht.
Unser Ziel war die Zusammensetzung der Bakterien translozierenden im peripheren Blut von HIV-infizierten Patienten zu charakterisieren. Um zu verfolgen unser Ziel wir eine PCR-Reaktion für die panbacteric 16S ribosomial Gen durch eine Sequenzanalyse gefolgt.
Kurz gesagt, ist Vollblut sowohl HIV-infizierten und gesunden Probanden verwendet. Da die gesunden Individuen normalen intestinalen Homöostase derzeit keine Translokation der Mikroflora wird bei diesen Patienten zu erwarten. Nach Vollblutspende durch Venenpunktion und Plasma-Trennung wird die DNA aus dem Plasma extrahiert und verwendet werden, um eine breite Palette PCR-Reaktion für die panbacteric 16S ribosomial Gen 9 Führen. Nach PCR-Produkt Reinigung, Klonierung und Sequenzierung Analysen durchgeführt.
Protocol
Discussion
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Gianni Scimone für hervorragende Unterstützung mit Video machen.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
References
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