Секвенирование бактериальной микрофлоры в периферической крови: Наш опыт работы с ВИЧ-инфицированных пациентов
Summary
Наш эксперимент покажет, как выполнить последовательность анализа видов бактерий translocating в периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов.
Abstract
Здоровый желудочно-кишечного тракта является физиологически колонизирована большое разнообразие комменсальной микробов, которые влияют на развитие гуморального и клеточного иммунного 1,2 слизистой системы.
Микробиоты защищена от иммунной системы с помощью сильного слизистый барьер. Инфекции и антибиотики, как известно, изменить как в нормальном, желудочно-кишечного тракта и барьер состав резидентов бактерий, которые могут привести к возможной иммунных нарушений 3.
ВИЧ вызывает нарушения в желудочно-кишечный барьер с прогрессивной провал иммунитет слизистой оболочки и утечки в системный кровоток бактериальных биопродуктов, таких как липополисахарида и бактериальных фрагментов ДНК, которые способствуют системной активации иммунной 4-7. Микробная транслокация замешана в борьбе с ВИЧ / СПИДом иммунопатогенеза и реакции на лечение 4,8.
Мы стремились, чтобы характеризовать состав бактерий translocating в периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Для осуществления нашей цели мы создали для реакции ПЦР для panbacteric 16S ribosomial генов последующим секвенирования.
Короче говоря, цельная кровь с обеих ВИЧ-инфицированных и здоровых людей используется. Учитывая, что здоровых людей настоящее нормальной кишечной гомеостаза не транслокация микрофлоры, как ожидается, у этих пациентов. После целого сбора крови из вены и плазмы разделение, ДНК, извлеченных из плазмы и используется для выполнения широкого спектра ПЦР-реакции panbacteric 16S ribosomial ген 9. После очистки продукт ПЦР, клонирования и секвенирования анализы выполняются.
Protocol
Discussion
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Джанни Scimone за отличную помощь с видео-решений.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
- Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
- Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
- Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
- Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
- Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
- Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. , (2010).
- Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).
