Nossa experiência vai mostrar como realizar uma análise de seqüenciamento de translocação de espécies bacterianas no sangue periférico de pacientes HIV positivos.
O trato gastrointestinal saudável é fisiologicamente colonizada por uma grande variedade de micróbios comensais que influenciam o desenvolvimento do sistema 1,2 humoral e celular imune da mucosa.
Microbiota é protegido do sistema imunológico através de uma forte barreira mucosa. Infecções e antibióticos são conhecidos por alterar tanto a barreira do trato gastrointestinal normal ea composição das bactérias residentes, o que pode resultar em possíveis alterações imunológicas 3.
HIV causa uma brecha na barreira gastrointestinal com insuficiência progressiva da imunidade da mucosa e vazamento para a circulação sistêmica de bioprodutos bacteriana, como lipopolissacarídeos e fragmentos de DNA de bactérias, que contribuem para a ativação imune sistêmica 4-7. Translocação microbiana está implicado em HIV / AIDS imunopatogênese e resposta à terapia 4,8.
Nosso objetivo foi caracterizar a composição de bactérias translocação no sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV. A perseguir o nosso objectivo é criar uma reação de PCR para o gene 16S panbacteric ribosomial seguido por uma análise de seqüenciamento.
Resumidamente, o sangue total de ambos os sujeitos infectados pelo HIV e saudável é usado. Dado que os indivíduos saudáveis apresentam homeostase intestinal normal não translocação de microflora é esperado nesses pacientes. Após a colheita de sangue total por punção venosa e separação do plasma, o DNA é extraído do plasma e usado para executar uma ampla gama reação de PCR para o gene 16S panbacteric ribosomial 9. Análises de purificação seguinte produto PCR, clonagem e sequenciamento são executadas.
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos a Gianni Scimone para assistência excelente, com tomada de vídeo.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
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Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
PCR primers | Invitrogen | ||
Agarose | Eppendorf | C1343 | |
DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
Bactoagar | Invitrogen | ||
Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |