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Immunology and Infection

सेल प्रकार विशिष्ट siRNA वितरण के लिए विरोधी एचआईवी gp120 aptamers का विकास

Published: June 23, 2011 doi: 10.3791/2954
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Shared Resource-DNA/RNA Peptide, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

कई 2'Fluoro nanomole आत्मीयता के साथ एचआईवी 1Ba एल gp120 खिलाफ आरएनए aptamers एक शाही सेना पुस्तकालय से अलग कर रहे हैं द्वारा

Protocol

1. शाही सेना पुस्तकालय की तैयारी

  1. शुरू डीएनए पुस्तकालय यादृच्छिक दृश्यों के 50 nucleotides निहित और एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजी (Coralville, आयोवा) द्वारा संश्लेषित किया गया था. एकल असहाय डीएनए oligo पुस्तकालय अनुक्रम 5'-GGG AGG ACG ATG CGG - एन 50 - सीएजी ACG अधिनियम CGC CCG एक - 3 '(81 NT के). यादृच्छिक क्षेत्र में लगातार क्षेत्रों, जो के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में T7 प्रमोटर और RT-पीसीआर के लिए एक 3 'के टैग में शामिल द्वारा flanked है. 5 'और 3' निरंतर अनुक्रम 5 '- TAA टीएसी GAC TCA CTA टैग GGA GGA CGA TGC GG - 3' (32 मेर) और 5 'TCG GGC भूमिकाः TCG TCT जी - 3' (16 मेर), क्रमशः. और aliquots में पानी की दुकान के साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान करें
  2. पीसीआर 5'-और 3'प्राइमरों के तीन सुक्ष्ममापी प्रत्येक के साथ 2 मिमी 2 MgCl और प्रत्येक dNTP के 200 सुक्ष्ममापी, एकल असहाय डीएनए oligo यादृच्छिक पुस्तकालय (0.4 सुक्ष्ममापी) बढ़ाना. आदेश में मूल डीएनए पुस्तकालय की बहुतायत को बनाए रखने के लिए, दस चक्र के लिए पीसीआर सीमा. पीसीआर प्रतिक्रियाओं (10 प्रतिक्रियाओं, प्रतिक्रिया प्रति μL 100) के बाद, प्रवर्धित dsDNA QIAquick जेल शुद्धि किट (QIAGEN) का उपयोग पूल ठीक हो.
  3. परिणामस्वरूप एक शाही सेना निर्माता के निर्देशों के अनुसार DuraScription किट (Epicentre, मैडिसन, WI) का उपयोग पुस्तकालय के करने के लिए dsDNA में कनवर्ट करें. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण में, 2'एफ CTP और 2'एफ UTP साथ CTP और UTP जगह ribonuclease प्रतिरोधी शाही सेना का उत्पादन. आमतौर पर, डीएनए टेम्पलेट, 2 μL x 10 बफर, 2 μL dATP, 2 μL dGTP, 2 μL 2'एफ dCTP, 2 μL 2'एफ dUTP, 2 μL डीटीटी शुद्ध 1 μg युक्त प्रतिक्रिया की 20 μL तैयार और कमरे के तापमान पर 2 μL T7 शाही सेना पोलीमरेज़ और फिर 37 पर सेते ° 6 एच. के लिए सी (प्रत्येक dNTP की 50 मिमी.)
  4. इसके बाद DNase मैं (प्रति 20 μL T7 प्रतिलेखन प्रतिक्रिया 1.5 μL) के साथ प्रतिक्रिया टेम्पलेट डीएनए को हटाने और एक 8% polyacrylamide / 7 एम यूरिया जेल से शुद्ध पचाने में. यूवी spectrophotometry द्वारा शुद्ध शाही सेना पुस्तकालय यों.

2. Aptamers में इन विट्रो पीढ़ी

  1. चयन से पहले, चयन बफर और refolding बफर तैयार. एक HEPES बफर 100 मिमी Hepes, पीएच 7.4 से युक्त तैयार. NaOH का उपयोग करें कमरे के तापमान पर पीएच तो और मूल्य की दुकान समायोजित. 5 मिमी MgCl 2; 5 मिमी 2 CaCl, 13.5 मिमी KCl एक शाही सेना refolding (5xHBS) बफर 50 मिमी Hepes पीएच 7.4, 750 मिमी NaCl युक्त तैयार करें . एक कम नमक शाही सेना बाध्यकारी बफर (10 मिमी 7.4 पीएच HEPES, 50 मिमी NaCl, 1 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी डीटीटी, 0.01% BSA और एक उच्च नमक शाही सेना बाध्यकारी बफर (10 तैयार मिमी 7.4 पीएच, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी डीटीटी, 0.01% BSA) HEPES. -20 ° सी. पर स्टोर इन buffers
  2. मुख्य रूप 1-4 वर्णित SELEX प्रदर्शन. पहले हर चयन दौर, refold 1xHBS बफर (10 मिमी 7.4 पीएच HEPES, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी CaCl 2, 1 मिमी 2 MgCl, 2.7 मिमी KCl), 95 के लिए गर्मी ° 3 मिनट के लिए सी में शाही सेना पूल और फिर धीरे - धीरे शांत 37 डिग्री सेल्सियस 37 पर ऊष्मायन जारी रखें ° C 10 मिनट के लिए.
  3. आम तौर पर, आदेश में nitrocellulose फिल्टर के साथ nonspecific बंधन, पूर्व सोखना को कम करने के लिए 30 मिनट के लिए एक nitrocellulose फ़िल्टर (HAWP फ़िल्टर, 0.45 सुक्ष्ममापी) शाही सेना पूल refolded, एचआईवी-1 बाल gp120 प्रोटीन लक्ष्य के साथ पहले ऊष्मायन.
  4. 4 करने के लिए पूर्व मंजूरी दे दी SELEX एक दौर के लिए 30 मिनट के लिए शाही सेना के कम नमक शाही सेना बाध्यकारी बफर में लक्ष्य प्रोटीन के साथ पूल सेते हैं. SELEX के चौथे दौर के बाद, एक उच्च नमक शाही सेना बाध्यकारी बफर का उपयोग करें. SELEX प्रगति के साथ, gp120 प्रोटीन की मात्रा को कम करने और प्रतियोगी खमीर tRNA वृद्धि के क्रम में aptamer चयन की तंगी में वृद्धि.
  5. चयन के पहले चक्र के लिए, 200 μL कम में पूर्व मंजूरी दे दी यादृच्छिक शाही सेना (40 μg, 1.5 nmol, 9x10 14 अणुओं) पूल और एचआईवी -1 बाल gp120 प्रोटीन (0.23 nmol, आरएनए / अनुपात 6.5 / 1 प्रोटीन ) सेते कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक rotating मंच पर नमक शाही सेना बाध्यकारी बफर है.
  6. पूर्व गीला nitrocellulose फिल्टर के माध्यम से प्रतिक्रिया पास और 1 एमएल बाध्यकारी बफर के साथ धोने.
  7. 200 95 μL elution बफर (7 एम यूरिया और 5 मिमी EDTA) ° 5 मिनट के लिए सी, phenol / क्लोरोफॉर्म और Microcon YM 30 कॉलम के साथ निकासी एकाग्रता द्वारा पीछा किया. साथ फिल्टर से बाध्य शाही सेना Elute
  8. रिवर्स बरामद आरएनए ThermoScript RT-पीसीआर प्रणाली (Invitrogen) का उपयोग पूल नक़ल और पीसीआर के 15 चक्र के लिए बढ़ाना.
  9. प्रवर्धित dsDNA एक QIAquick जेल शुद्धि किट का उपयोग पूल शुद्ध टाइप करना और के रूप में चयन के अगले दौर के लिए ऊपर वर्णित है.

3. SELEX प्रगति फिल्टर बाध्यकारी परख द्वारा निगरानी

  1. फिल्टर बाध्यकारी परख द्वारा aptamers के SELEX प्रगति मॉनिटर. CIP के साथ शाही सेना पूल का इलाज करने के लिए टी -4 polynucleotide kinase और γ-32P-एटीपी के साथ 5'-triphosphate की शुरुआत और फिर लेबल हटाने के लिए.
  2. हीट CIP 10 pmol 95 शाही सेना पुस्तकालय इलाज ° 5 मिनट के लिए सी और फिर बर्फ पर ठंड. बाद में, 2 जोड़PNK बफर, 1 टी -4 polynucleotide kinase की μL, गामा पी 1 μL 32-एटीपी और 20 μL के लिए पानी की μL.
  3. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए, तो 20 ^ म्यू जोड़ने, पानी के एल और जी 50-स्तंभ द्वारा प्रतिक्रिया शुद्ध. अंत में, 250 एनएम के अंतिम एकाग्रता में लेबल शाही सेना के 40 μL प्राप्त करते हैं.
  4. परख के पहले, refold लेबल 1xHBS बफर (10 मिमी 7.4 पीएच HEPES, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी CaCl 2, 1 मिमी 2 MgCl, 2.7 मिमी KCl), 95 के लिए गर्मी में शाही सेना पूल डिग्री सेल्सियस 3 मिनट और फिर धीरे धीरे शांत के लिए 37 डिग्री सेल्सियस 37 पर ऊष्मायन जारी रखें ° C 10 मिनट के लिए.
  5. उदाहरण के रूप में बाध्यकारी प्रतिक्रिया यहाँ के एक 100 μL कैर्री. सेते अंत लेबल gp120 प्रोटीन (100 एनएम) और एक 30 मिनट के लिए उच्च नमक शाही सेना बाध्यकारी बफर में nonspecific प्रतियोगी tRNA (100 एनएम) के 10 गुना दाढ़ अधिक के साथ शाही सेना पूल (10 एनएम).
  6. पूर्व गीला nitrocellulose फ़िल्टर द्वारा बाध्यकारी प्रतिक्रिया के एक 50 μL अलग.
  7. 2 एमएल बाध्यकारी बफर के साथ फिल्टर धो और रेडियोधर्मिता गिनती जगमगाहट बहु प्रयोजन के काउंटर (Beckman कल्टर) के माध्यम से फिल्टर पर बनाए रखा. एक इनपुट नियंत्रण के रूप में, एक ही समय में शेष बाध्यकारी प्रतिक्रिया के 50 μL गिनती. शाही सेना के प्रतिशत परिकलित बंधन आकर्षण के रूप में इनपुट शाही सेना में फिल्टर पर बनाए रखा है.

4. क्लोनिंग अनुक्रमण, और संरेखण

  1. 11 राउंड के बाद, अगर कोई आगे संवर्धन भी अतिरिक्त चयन राउंड के बाद मनाया जाता है तो शाही सेना पूल के अधिक से अधिक बाध्यकारी संभावित पहुँच दिया गया है.
  2. अत्यधिक समृद्ध aptamer पूल (12 वें शाही सेना पूल) ThermoScript RT-पीसीआर प्रणाली (Invitrogen) का उपयोग नक़ल रिवर्स और बाद में पीसीआर द्वारा सीडीएनए परिणामस्वरूप बढ़ाना. पीसीआर उत्पाद QIAquick जेल शुद्धि किट (QIAGEN) का उपयोग कर शुद्ध. क्लोन जेल टीए क्लोनिंग वेक्टर 2.1 पीसीआर (Invitrogen) में डीएनए उत्पाद शुद्ध. कुल में, 170 व्यक्तिगत क्लोन टीका लगाना और आगे उन्हें व्यक्तिगत दृश्यों प्राप्त करने के लिए डीएनए अनुक्रमण द्वारा पहचान.
  3. व्यक्तिगत aptamer दृश्यों के संरेखण पर आधारित छह अलग समूहों में अलग - अलग क्लोन वर्गीकृत. आगे लक्षण वर्णन के लिए प्रत्येक (A-1, एक 5, एक 9, A-12, A-28 और बी 68) अपने समूह के भीतर उनके रिश्तेदार बहुतायत के कारण समूह से एक प्रतिनिधि अनुक्रम चुना.

5. Aptamer और कल्पना RNAs के द्वारा इन विट्रो प्रतिलेखन में पीढ़ी

  1. सीधे पीसीआर 5'-और 3'प्राइमरों के 2 सुक्ष्ममापी प्रत्येक के साथ 2 मिमी 2 MgCl और प्रत्येक dNTP के 200 सुक्ष्ममापी, डबल असहाय डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न है, और जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर एक QIAquick जेल शुद्धि किट उत्पादों का उपयोग कर ठीक है.
  2. अपने पीसीआर उत्पन्न डीएनए DuraScription किट (Epicentre, मैडिसन, WI) का उपयोग टेम्पलेट्स से कल्पना भावना कतरा टाइप करना. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण में, 2'एफ CTP और 2'एफ UTP के साथ विहित CTP और UTP को प्रतिस्थापित करने के लिए शाही सेना है कि RNase एक गिरावट के लिए प्रतिरोधी है.
  3. आमतौर पर, डीएनए टेम्पलेट की एक μg, 2 एमएल 10xbuffer, 2 μL dATP, 2 μL dGTP, 2 μL 2'एफ dCTP, 2 μL 2'एफ dUTP, 2 μL डीटीटी और 2 μL युक्त प्रतिक्रिया की 20 μL सेते T7 37 में शाही सेना पोलीमरेज़ ° सी 6 घंटे के लिए, और बाद में यह जैव स्पिन phenol के निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा के बाद 30 कॉलम (जैव रेड) के साथ शुद्ध.
  4. आदेश में इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया से बचने के लिए, आगे CIP द्वारा लिखित आरएनए के इलाज के लिए शुरुआत 5'-triphosphate हटायें. ° 60 मिनट के लिए सी 37 पर टेप के 3 μg, 3 बफर के 6 μL और CIP के 0.25 μL युक्त प्रतिक्रिया की कुल 60 μL सेते हैं. / Phenol क्लोरोफॉर्म तक़ाज़ा और इथेनॉल वर्षण, पानी में resuspend आरएनए गोली के बाद.
  5. Chimeras तैयार करने के लिए, उपयुक्त antisense शाही सेना के साथ बफर, गर्मी, refolding में केवल भावना कतरा शाही सेना शरण chimeras गठबंधन 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट और फिर 37 के लिए अच्छा के लिए ° सी धीरे धीरे. 37 पर ऊष्मायन जारी रखें ° C 10 मिनट के लिए. Finial 1xHBS बफर पर कदम refolding प्रदर्शन. उदाहरण के लिए: मिश्रण 10 कल्पना भावना कतरा सुक्ष्ममापी 10 μL, 10 सुक्ष्ममापी antisense भूग्रस्त और 5 25 μL प्रणाली में μL refolding बफर (5xHBS) के 10 μL.

6. हदबंदी स्थिरांकों का जेल पाली assays के द्वारा निर्धारण

  1. अंत प्रत्येक समूह और chimeras भावना कतरा से 32 लेबल प्रतिनिधि aptamer और फिर refold 1xHBS बफर में शाही सेना के रूप में ऊपर वर्णित पी.
  2. 10xTBE ​​बफर की 2.5 एमएल 40% समाधान acrylamide बीआईएस / एमएल 19.375, पानी, 150 10% (ए पी एस) अमोनियम persulfate समाधान, और 30 μL TEMED की μL 3.125 एमएल के साथ, मिश्रण द्वारा 5% की जेल की 25 एमएल की तैयारी. जेल के बारे में 30 मिनट में polymerize चाहिए. ध्यान कंघी को हटाने और एक 30 एमएल चल बफर (1xTBE) के साथ कुओं को धोने के लिए एक सुई के साथ लगे सिरिंज का उपयोग करें.
  3. जेल इकाई के विधानसभा पूरा करें और एक बिजली की आपूर्ति कनेक्ट. जेल जा सकता है एक घंटे के लिए 180 वी पर 4 बजे ° पूर्व चलाने सी.
  4. Serially वांछित सांद्रता के लिए बाध्य बफर के साथ एचआईवी 1Bal gp120 प्रोटीन पतला. अंतिम rgp120 की eaction सांद्रता 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 एनएम हैं. 5'-P 32 के अंत लेबल शाही सेना बाध्यकारी बफर में gp120 प्रोटीन की वृद्धि कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक rotating मंच पर सांद्रता (20 कुल प्रतिक्रिया की μL) के साथ (10 एनएम) के एक निरंतर राशि सेते हैं.
  5. ऊष्मायन के बाद, 5 μL देशी लोड हो रहा है और एक 5% polyacrylamide गैर denaturing जेल में बफर लोड के साथ बाध्यकारी प्रतिक्रिया के 20 μL मिश्रण. 1 मिमी EDTA, 0.1% Bromophenol ब्लू, 0.1% Xylene Cyanol एफएफ, 0.1% ऑरेंज जी, 40% ग्लिसरॉल, एक देशी लोड हो रहा है (4x) बफर 10 मिमी Tris - एचसीएल, पीएच 7.5 से युक्त तैयार. Aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  6. निम्नलिखित वैद्युतकणसंचलन (4 पर 180 वी ° सी 2 घंटे के लिए, जब तक माध्यमिक डाई जेल के बीच रन पर), एक फ़ॉस्फ़र छवि स्क्रीन जेल बेनकाब और एक आंधी स्कैनर का उपयोग कर रेडियोधर्मिता यों.
  7. पृथक्करण एक ग्राफ़ पैड चश्मे के साथ गैर रेखीय वक्र प्रतिगमन का उपयोग स्थिरांक की गणना.

7. प्रवाह cytometry द्वारा सेल सतह बाध्यकारी अध्ययन

  1. फ्लोरोसेंट aptamer और chimeras रवशामक siRNA लेबल किट (Ambion) का उपयोग करते हुए उत्पन्न करें. आदेश में निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें: 22.5 μL nuclease मुफ्त पानी, 5 एमएल 10 x लेबल बफर, 15 μL (5 μg) शाही सेना, 7.5 μL लेबल डाई. 37 में कुल 50 μL लेबलिंग प्रतिक्रिया ° सी 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  2. ऊष्मायन के बाद, 5.0 (0.1 खंड) μL 5 NaCl एम और 125 (2.5 खंड) μL ठंड 100% EtOH, जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से. -20 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं. 20 मिनट के लिए 4 ° C पर शीर्ष गति से अपकेंद्रित्र. 175 μL 70% EtOH के साथ सतह पर तैरनेवाला धोने और गोली निकालें. एयर सूखी गोली अंधेरे में और फिर nuclease मुफ्त पानी के 15 μL में लेबल शाही सेना को रोक देते हैं.
  3. 260 एनएम और फ्लोरोसेंट रंजक के लिए absorbance के अधिकतम पर लेबल शाही सेना के absorbance के उपाय. डाई अनुपात और द्वारा प्रदान कैलकुलेटर के अनुसार शाही सेना एकाग्रता: आधार परिकलित http://www.ambion.com/techlib/append/base_dye.html .
  4. मिक्स Cy3 लेबल chimeras भावना किनारा और antisense और बफर refolding ऊपर वर्णित के रूप में refold कतरा.
  5. चो - WT प्राप्त एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम 5, 6 के माध्यम से gp160 और चो ई नियंत्रण कोशिकाओं व्यक्त. GMEM - एस मध्यम में कोशिकाओं (Glutamine 400 methionine sulfoximine (MSX) सुक्ष्ममापी की कमी के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम) (Gibco, Invitrogen) आगे बढ़ें. संस्कृति 37 पर एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस
  6. Prewarmed धोने बफर के साथ चो - WT gp160 या चो ई नियंत्रण कोशिकाओं धो trypsinize, और प्लेटों से अलग है. कोशिकाओं 500 μL बाध्यकारी बफर के साथ दो बार धोने के बाद, 37 पर बाध्यकारी बफर और सेते में सेल छर्रों resupend ° C 30 मिनट के लिए. गोली कोशिकाओं और फिर उन्हें prewarmed बाध्यकारी 400 एनएम Cy3 लेबल प्रयोगात्मक RNAs युक्त बफर के 50 μL में resuspend.
  7. 37 पर ऊष्मायन के बाद डिग्री सेल्सियस 40 मिनट के लिए, कोशिकाओं prewarmed बाध्यकारी बफर के 500 μL के साथ तीन बार धो, और अंत में बाध्यकारी बफर के 350 μL में resuspend 37 तक prewarmed डिग्री सेल्सियस और तुरंत प्रवाह cytometry से विश्लेषण.

8. लाइव सेल confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा internalization और intracellular स्थानीयकरण अध्ययन

  1. परख के एक दिन पहले, 2 एमएल-एस GMEM मध्यम में 6 0.3x10 पर बोने के साथ 35 मिमी प्लेट में चो - WT gp160 और चो ई नियंत्रण कोशिकाओं के बारे में 70% 24 एच. में संगम की अनुमति बढ़ने
  2. प्रयोगों के दिन, prewarmed पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं धो लो. और 37 में पूर्व गर्म 30 मिनट के लिए पूरी तरह से मध्यम विकास के 1 एमएल के साथ सेते डिग्री सेल्सियस
  3. Cy3 लेबल aptamer - siRNA chimeras की तैयारी के रूप में ऊपर वर्णित है. SiRNA छड़ी 5'-Cy3 लेबल भावना कतरा युक्त aptamer छड़ी siRNA संयुग्मित फार्म के रूप में ऊपर वर्णित के साथ aptamer छड़ी refold सेते हैं.
  4. परख के पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर और aliquots में पानी की दुकान में +३३,३४२ Hoechst (परमाणु डाई जीवित कोशिकाओं के लिए, आण्विक जांच, Invitrogen, सीए) की 0.15 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार
  5. 0.15 मिलीग्राम / एमएल 33342 Hoechst के साथ इलाज के द्वारा कोशिकाओं के 37 में 15 मिनट के लिए दाग डिग्री सेल्सियस तत्काल, 1.0 एमएल ताजा माध्यम के साथ डाई धोने दो बार और जगह 2 एमएल ताजा मध्यम prewarmed.
  6. Cy3 लेबल एक 100 एनएम और एक 5% सीओ 2 माइक्रोस्कोपी इनक्यूबेटर में रहते सेल confocal माइक्रोस्कोपी के लिए मीडिया सेते में अंतिम एकाग्रता में कल्पना aptamer - siRNA में 37 डिग्री सेल्सियस जोड़ें
  7. छवियों को हर 15 मिनट का उपयोग कर एक Zeiss LSM 510 40x बढ़ाई पानी विसर्जन के तहत 2 फोटॉन confocal खुर्दबीन प्रणाली उल्टे मेटा लीजिए.

9. इन विट्रो चुनौती एचआईवी -1 और p24 प्रतिजन परख

  1. ATCC से CCRF CEM कोशिकाओं खरीद. RPMI 1640 में ग्रो (Cellgro, Mediatech इंक) 10% भ्रूण गोजातीय (FBS, HyClone) सीरम, एल glutamine और 1xPen Strep (Gibco, Invitrogen) के साथ पूरक. एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 में संस्कृति कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस
  2. परिधीय रक्त mononucle प्राप्तआशा है कि नेशनल मेडिकल सेंटर (क्लिनिक कर्मियों) के सिटी से स्वस्थ दाताओं से गिरफ्तारी नमूने हैं.
  3. पूरे रक्त से PBMCs Ficoll - Hypaque समाधान के माध्यम से centrifugation (Histopaque 1077, सिग्मा) द्वारा अलग. PBMCs से CD8 कोशिकाओं (T-cytotoxic/suppressor सेल) Dynabeads CD8 (Invitrogen, सीए) का उपयोग करके चूस लेना.
  4. टी सेल सक्रिय माध्यम से कोशिकाओं को विकसित (BioE, सेंट पॉल, MN). एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 में संस्कृति कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस
  5. एचआईवी-1 IIIB और NL4-3 और एचआईवी एड्स के शोध और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम से 1 बाल वायरस वायरस प्राप्त करते हैं. वायरस -80 पर aliquots में दुकान डिग्री सेल्सियस के प्रसार के बाद
  6. संक्रमित CCRF CEM कोशिकाओं या एचआईवी वायरस के साथ मानव PBMCs (IIIB, NL4 3 या बाल) (0.001 MOI या .005). के बाद संक्रमण के 24 घंटे के बाद, धीरे पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं को मुक्त वायरस को दूर धोने के लिए. संस्कृति के लिए 37 पर एक 5% सीओ 2 माइक्रोस्कोपी इनक्यूबेटर में संक्रमित कोशिकाओं ° C 4 दिनों के लिए आगे बढ़ें .
  7. उपचार शाही सेना के पहले, धीरे पीबीएस तीन बार से संक्रमित कोशिकाओं को मुक्त वायरस को दूर धोने के लिए. सेते 2x10 4 संक्रमित कोशिकाओं के साथ और 3x10 4 असंक्रमित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस (, triplex परख के प्रति अच्छी तरह से 100 μL) पर 400 एनएम के लिए प्रयोगात्मक RNAs के अंतिम एकाग्रता refolded 96 अच्छी तरह प्लेटें में.
  8. संस्कृति supernatants (अच्छी तरह से 10 प्रतिशत μL) अलग समय (3 घ, घ 5, 7 घ और घ 9) और -20 डिग्री सेल्सियस पर p24 परख जब तक दुकान पर ले लीजिए.
  9. P24 प्रतिजन एक एचआईवी -1 p24 एंटीजन एलिसा किट का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन करना.

10. मात्रात्मक परख RT-पीसीआर द्वारा siRNA समारोह का पता लगाने

  1. CCRF - CEM एचआईवी वायरस (IIIB, NL4 3 या बाल) के साथ या कोशिकाओं मानव PBMCs संक्रमित हैं और प्रयोगात्मक (400 एनएम) RNAs के रूप में ऊपर वर्णित के साथ इलाज.
  2. उपचार, गोली कोशिकाओं और के 7 दिनों के के बाद स्टेट-60 के साथ कुल RNAs अलग. जीनोमिक डीएनए निकालने और सीडीएनए का उत्पादन कुल शाही सेना के 2 μg का उपयोग DNase मैं के साथ कुल RNAs समझो.
  3. , 1.5 एमएल 10 x DNase बफर, 4 μL शाही सेना (2 μg); 0.5 μL RNain अवरोध करनेवाला और 1.0 μL RNase - मुक्त DNase मैं सेते कुल 1 के लिए 15 μL प्रतिक्रिया 37 डिग्री सेल्सियस 8 एमएल पानी nuclease मुक्त: निम्नलिखित अभिकर्मकों मिक्स घंटे और 80 पर गर्मी डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए DNase मैं निष्क्रिय करने के लिए तत्काल, बर्फ पर प्रतिक्रिया चिल.
  4. 65 में 2 μL यादृच्छिक (50 / एनजी μL) किताब और 1μL dNTP प्रतिक्रिया ऊपर मिश्रण में (10 मिमी), और फिर गर्मी जोड़ें ° सी के 5 मिनट के लिए. तत्काल, बर्फ पर प्रतिक्रिया चिल.
  5. निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें: 5 एमएल 5xFirst किनारा बफर, 2.5 एमएल 0.1 एम डीटीटी, 0.5 एमएल RNain अवरोध करनेवाला और 1.0 MMLV - आरटी एमएल. 25 में कुल 27 एमएल प्रतिक्रिया सेते ° 10 मिनट के लिए और 37 पर 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस सी. प्रतिक्रिया, 70 पर गर्मी मिश्रण के बाद डिग्री सेल्सियस 15 मिनट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रिय करने के लिए और फिर बर्फ पर ठंड के लिए. सीडीएनए QRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए तैयार है.
  6. मात्रात्मक RT-पीसीआर 400 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता (ट्रिप्लैक्स परख) 2 एक्स बुद्धि SyberGreen Mastermix और विशिष्ट प्राइमर सेट का उपयोग करके लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें. QPCR डेटा के सामान्य के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में GAPDH अभिव्यक्ति का उपयोग करें.

11. प्रतिनिधि परिणाम:

1. नई आरएनए aptamers एचआईवी -1 बाल gp120 के खिलाफ अलग कर रहे हैं और विशेषता है .

प्रायोगिक खंड, एक प्रारंभिक डीएनए oligonucleotide एक 50 NT के यादृच्छिक 5 'और 3' समाप्त होता है प्रवर्धित है और एक शाही सेना पूल में लिखित पर तय प्राइमर क्षेत्रों द्वारा flanked क्षेत्र युक्त पुस्तकालय में वर्णित है. 10 15 विविध (1 nmol) दृश्यों, जो विभिन्न 3 डी संरचनाओं का एक विशाल सरणी में गुना की यह प्रारंभिक पुस्तकालय होते हैं. उच्च प्रारंभिक पुस्तकालय की जटिलता और विविधता अच्छा लक्ष्य बाध्यकारी आत्मीयता के साथ सक्रिय संरचनाओं की उपस्थिति की गारंटी हो सकता है.

इन विट्रो SELEX प्रक्रिया में (चित्रा 1) रोजगार 2'fluoropyrimidine संशोधित आरएनए aptamers जो चुनिंदा R5 तनाव एचआईवी 1 BAL gp120 लिफाफा 7 प्रोटीन बाँध का चयन करें. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, एक चयन nitrocellulose आधारित रणनीति गैर बाध्यकारी शाही सेना अणु से विशिष्ट लक्ष्य बाध्यकारी RNAs को अलग किया जाता है. के बाद से प्रोटीन nitrocellulose चिपक जाती है, केवल शाही सेना / प्रोटीन परिसरों या समुच्चय झिल्ली पर बनाए रखा जा सकता है और मुक्त RNAs के बाहर धो रहे हैं. Denaturing शर्तों के तहत, बाध्य RNAs बरामद कर रहे हैं और रिवर्स सीडीएनए लिखित और फिर dsDNA में परिलक्षित, और बाद में इन विट्रो अगले चयन चक्र के लिए एक नई आरएनए पूल बनाने के लिए लिखित. चयन तंगी लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा को कम करने और प्रतियोगी tRNA की राशि में वृद्धि की वृद्धि हुई है. शाही सेना पूल, प्रोटीन और प्रतियोगी tRNA प्रत्येक चयन के दौर में इस्तेमाल की राशि तालिका 1 में दिखाया गया है .

फिल्टर बाध्यकारी परख द्वारा प्रत्येक SELEX चक्र के बाद चयन की प्रगति मॉनिटर. बंधन आत्मीयता का मूल्यांकन के रूप में शाही सेना के प्रतिशत fil पर बनाए रखाकुल शाही सेना पूल में आतंकवाद. शुरू आरएनए पूल (1 शाही सेना) केवल इनपुट झिल्ली पर बनाए रखा RNAs के 0.1% से पता चलता है. हालांकि, नौ चयन दौर के बाद नौवें शाही सेना पुस्तकालय (9 आरएनए) इनपुट शाही सेना के 9.72% बाध्य है. हालांकि अतिरिक्त चयन दौर आयोजित किया गया, आगे कोई संवर्धन मनाया जाता है, सुझाव है कि शाही सेना के पूल के अधिक से अधिक बाध्यकारी तक पहुँच गया है (2A चित्रा). फिल्टर बाध्यकारी परख के साथ इसी प्रकार, जेल शिफ्ट परख भी पृथक्करण स्थिरांक का निर्धारण करने के लिए सबसे लोकप्रिय रणनीति है. यह प्रक्रिया आसान और सुविधाजनक है. के रूप में चित्र 2B में दिखाया गया है, जेल पाली assays के आगे आरएनए पूल के बंधन गतिविधियों की पुष्टि की. इन परिणामों दिखाना है कि लक्ष्य प्रोटीन के लिए उच्च बाध्यकारी विशिष्टता के साथ कुछ ligands क्रमिक इन शाही सेना पूल में समृद्ध कर रहे हैं ..

क्लोन और अत्यधिक समृद्ध aptamer पूल (12 आरएनए) अनुक्रम. व्यक्तिगत क्लोन aptamer दृश्यों के संरेखण के अनुसार, छह अलग समूहों में वर्गीकृत कर रहे हैं के रूप में तालिका 2 में दिखाया गया है. (ए / जी) TTGAGGGACC (ए जी /): क्लोन के बारे में 40% (aptamers समूह मैं और द्वितीय) एक संरक्षित अनुक्रम होते हैं. अपने समूह के भीतर उनके रिश्तेदार बहुतायत के कारण आगे लक्षण वर्णन के लिए: (A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 और B-68 उदाहरण के लिए) हम प्रत्येक समूह से एक प्रतिनिधि के अनुक्रम का चयन करें. एक देशी जेल गतिशीलता बदलाव परख के माध्यम से, इन प्रतिनिधि aptamers के पृथक्करण स्थिरांक (कश्मीर घ) (चित्रा 3A) की गणना कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, A-1, aptamers का सबसे अच्छा में है, 52 एनएम (3B चित्रा) की एक स्पष्ट केडी मूल्यों है. चित्रा 3A में दिखाया गया है, इन चयनित aptamers चुनिंदा लक्ष्य एचआईवी -1 gp120 बाल के साथ बाँध कर सकते हैं, लेकिन नहीं एचआईवी gp120 मुख्यमंत्री प्रोटीन .

2. एंटी - gp120 aptamer विशेष रूप से बांध और gp160 एचआईवी व्यक्त कोशिकाओं द्वारा भली भाँति है और सेल संस्कृति में एचआईवी -1 संक्रमण को बाधित.

चो gp160 stably एचआईवी लिफाफा glycoprotein gp160 व्यक्त कोशिकाओं के लिए चयनित विरोधी gp120 aptamers के बंधन और internalization के लिए परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन कोशिकाओं gp160 gp120 और gp41 में प्रक्रिया नहीं है क्योंकि वे ढकोसला इनकोडिंग लिफाफा प्रसंस्करण के लिए आवश्यक proteases की कमी. किसी नियंत्रण के रूप में हम पैतृक सेल चो ई लाइन जो gp160 व्यक्त नहीं करता है का उपयोग करें. प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा -4 ए) से पता चलता है कि Cy3 - लेबल aptamers विशेष रूप से करने के लिए बाध्य चो - gp160 कोशिकाओं लेकिन चो - ई कोशिकाओं नहीं नियंत्रण. इसके अलावा, वास्तविक समय रहते सेल Z-अक्ष confocal माइक्रोस्कोपी इंगित करता है कि Cy3 - लेबल aptamer चुनिंदा ऊष्मायन के 2 घंटे के बाद चो gp160 कोशिकाओं (4B चित्रा और 4C) के भीतर भली भाँति है, लेकिन चो ई नियंत्रण नहीं कोशिकाओं ( चित्रा 4D 4C). चित्रा भी पता चलता है कि aptamer cytoplasm, जो पता चलता है gp120 aptamers शायद रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश के भीतर एकत्रित.

एचआईवी -1 चुनौती परख में एचआईवी -1 से संक्रमित PBMC कोशिकाओं aptamers के साथ व्यवहार कर रहे हैं. अलग - अलग दिनों में aptamers के साथ इलाज के बाद, वायरल p24 प्रतिजन स्तर (चित्रा 4E) के लिए मीडिया के aliquots assayed हैं. परिणाम बताते हैं कि विरोधी gp120 aptamers (A-1) नैनो Molar एकाग्रता के साथ एचआईवी -1 p24 उत्पादन रोकता है.

3. विरोधी gp120 aptamer - siRNA कल्पना डिजाइन और सेल प्रकार के विशिष्ट siRNA वितरण प्रणाली के रूप में अपनी प्रभावकारिता का मूल्यांकन

चित्रा 5A, aptamer और nuclease प्रतिरोधी 2'Fluoro UTP और 2'Fluoro CTP निहित siRNAs की भावना कतरा खंड में दिखाया गया है और इन विट्रो जीवाणुभोजी प्रतिलेखन में इसी dsDNA खाके से संश्लेषित. आदेश में अणु के लचीलेपन को बढ़ाने के लिए, एक दो nucleotide linker (UU) aptamer और पासा खेलनेवाला सब्सट्रेट भाग के बीच डाला जाता है. Chimeras युक्त siRNA तैयार करने के लिए, इन विट्रो लिखित chimeric aptamer भावना कतरा पॉलिमर में एक असंशोधित antisense कतरा शाही सेना की equimolar सांद्रता के साथ annealed हैं. जेल शिफ्ट (चित्रा 5B) परख और प्रवाह cytometry (चित्रा 5C) से इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि chimeras अकेले aptamers के रूप में लगभग एक ही बाध्यकारी समानताएं बनाए रखने है. वास्तविक समय confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5D) से समय पाठ्यक्रम छवियों चलता है कि A-1 Ch कल्पना सफलतापूर्वक कोशिकाओं के cytoplasm में भली भाँति किया जा सकता है है Cy3 लेबल. जैसी उम्मीद थी, कल्पना की कोई तेज चो EE नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 5E) के साथ मनाया जाता है .

इसी तरह, RNAs के antiviral क्षमता एचआईवी-1 चुनौती परख द्वारा मूल्यांकन किया है. एचआईवी p24 प्रतिजन विश्लेषण (चित्रा 6A और 6B) के परिणाम बताते हैं कि दोनों aptamer और कल्पना p24 उत्पादन रोकना है, लेकिन मजबूत निषेध कल्पना Ch के एक - एक उपचार के साथ मनाया जाता है.

पुष्टि करते हैं कि siRNA घटक साथ APTA के साथ कार्य कर रहा हैमेर, A-1 संक्रमित कोशिकाओं में कल्पना चौधरी के internalization के बाद, हम भी मात्रात्मक RT-पीसीआर अभिव्यक्ति assays द्वारा / गूंथना राजस्व जीन अभिव्यक्ति के निषेध के रिश्तेदार स्तर का मूल्यांकन. हम पाते हैं कि chimeras से संक्रमित कोशिकाओं के इलाज जैसे / राजस्व जीन का मुंह बंद प्रेरित करने में सक्षम है, जबकि अकेले aptamer गूंथना / राजस्व जीन की अभिव्यक्ति (चित्रा 6C और 6D) को प्रभावित नहीं किया. इन परिणामों के आगे समर्थन है कि aptamer दिया siRNA आरएनएआई चलाता प्रदान.

प्रोटीन की मात्रा, शाही सेना पूल और tRNA चयन के लिए इस्तेमाल किया
SELEX दौर लक्ष्य के अनुपात / आरएनए Gp120 प्रोटीन शाही सेना पूल प्रतियोगी tRNA चयन बफर
1 1/6.5 229.8 pmol 1.5 nmol (40.1 μg) 0 कम नमक SELEX बफर
2 1/6.5 114.9 pmol Nmol 0.75 (20.1 μg) Nmol 0.25 (6.6 μg)
3 1 / 8 76.6 pmol 0.625 nmol (16.7 μg) Nmol 0.25 (6.6 μg)
4 1 / 8 76.6 pmol 0.625 nmol (16.7 μg) Nmol 0.25 (6.6 μg)
5 1 / 8 38.3 pmol 0.306 nmol (8.18 μg) 0.5 nmol (13.2 μg) उच्च नमक SELEX बफर
6 1 / 8 38.3 pmol 0.306 nmol (8.18 μg) 0.5 nmol (13.2 μg)
7 1 / 10 26.8 pmol 0.268 nmol (7.16 μg) 0.5 nmol (13.2 μg)
8 1 / 10 26.8 pmol pmol 0.268 nmol (7.16 μg) 1 nmol (26.4 μg)
9 1 / 10 15.3 pmol 0.153 nmol (4.09 μg) 1 nmol (26.4 μg)
10 1 / 10 15.3 pmol 0.153 nmol (4.09 μg) 1.5 nmol (39.6 μg)
11 1/12.5 7.66 pmol 0.096 nmol (2.56 μg) 2 nmol (52.8 μg)
12 1/12.5 7.66 pmol 0.096 nmol (2.56 μg) 2 nmol (52.8 μg)

1 टेबल चयन शर्तें. प्रोटीन की मात्रा, शाही सेना पूल और tRNA प्रत्येक चयन और चयन बफर के लिए इस्तेमाल किया संकेत कर रहे हैं.

समूह शाही सेना यादृच्छिक दृश्यों आवृत्ति (140 क्लोनों)
समूह मैं A-1 AATTGAGGGACCA CGCGCTGCTTGTTGTGATAAGCAG TTTGT तटरक्षक GATGG 33 (23.6%)
B-7 AATTGAGGGACCA ACGCGAGGATGTGGATAGTGTGTA TTTGC जी.टी. GATGG 3
A-32 AATTGAGGGACCG TTGGTAAAAGCCGGA AATTG AGCT TTTAC GGC GATGG 5
B-55 AATTGAGGTACCGCG TTATTAGGAACA AATTG GAATTCTAAACGC GATGG 2
A-24 AATAGAGGGACC CAGATATAGGCTACACGGATGATGGTGTATCTG GATGG 1
B-19 AATAGAGGAACCG TTTCAGAAGACTACAGGTTAGTCCAATGAAGC GACGG 1
B-31 AATAGAGGGACCG TGGACAATAATTTATGGTCA TTTATTGGCAC GATGG 1
समूह द्वितीय A-12 AGTAGAGGAACCA AGCAATGGATGAATGCAAAAGTGTAAATGCTT GATGG 10 (7.1%)
समूह III A-9 TGAGTTTGGGTAAATTTCCGGTTTCGGTTTACTCACGAAAGATCGGTCGG 15 (10.7%)
समूह चतुर्थ A-28 TAAAGGAGGGAAGGATGAGACCGCACGAAAAATATCAGCATACG TTTGTG 10 (7.1%)
समूह वी A-5 GAAACTAGTTTGAATAATGGTGTAGAGGAGGGTCAATAGTTTCG TTGGTG 9 (6.4%)
समूह छठी B-68 ACATAGTAATGACACGGAGGATGGAGAAAAAACAGCCATCTCTTGACGGT 2
दूसरों अनाथ अनुक्रम 48

टेबल 2. संरेखण और आरएनए aptamers की पहचान. चयन के 12 वें दौर के बाद, चयनित आरएनए पूल क्लोन और अनुक्रम . सभी 140 क्लोन के संरेखण के बाद, विरोधी gp120 aptamers के छह समूहों की पहचान की गई. केवल aptamer मुख्य क्षेत्रों में से एक यादृच्छिक अनुक्रम (5'-3 ') का संकेत कर रहे हैं. एकाधिक आवृत्तियों के साथ होने वाली आइसोलेट्स निर्दिष्ट कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1: इन विट्रो चयन प्रक्रिया में योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व nitrocellulose झिल्ली एचआईवी -1 बाल gp120 प्रोटीन के लिए शाही सेना aptamers पैदा करने के लिए, का उपयोग. (ए) शुरू शाही सेना पूल और लक्ष्य प्रोटीन जटिल प्रपत्र incubated रहे थे . (बी) बाध्य शाही सेना अणु झिल्ली पर बनाए रखा गया और denaturing शर्त के तहत झिल्ली से eluted. (सी) अनबाउंड RNAs धुल गया. (डी) चयनित RNAs रिवर्स और लिखित पीसीआर से परिलक्षित थे. (ई) प्रासंगिक डीएनए बाद अगले चयन चक्र के लिए नई आरएनए पूल में लिखित था. (एफ) 10-15 चयन दौर के बाद, चयनित aptamers क्लोन थे और अनुक्रम .

चित्रा 2
चित्रा 2: एचआईवी -1 gp120 aptamers चयन की प्रगति. (ए) प्रत्येक चक्र में शाही सेना के पूल के बाध्यकारी गतिविधि प्रतियोगी tRNA के साथ फिल्टर बाध्यकारी परख से विश्लेषण किया गया था. बंधन गतिविधियों आरएनए प्रोटीन / जटिल शाही सेना में फिल्टर पर बनाए रखा इनपुट का प्रतिशत के रूप में गणना की गई. (ख) प्रत्येक चक्र में शाही सेना के पूल के बाध्यकारी गतिविधि जेल शिफ्ट परख द्वारा विश्लेषण किया गया था. 12 वें शाही सेना पूल उच्चतम बाध्यकारी गतिविधि दिखाया.

चित्रा 3
चित्रा 3: gp120 बाल एचआईवी -1 के खिलाफ चयनित व्यक्ति aptamers के बंधन गतिविधि परख . (ए) 5'-अंत पी 32 लेबल व्यक्तिगत aptamers लक्ष्य प्रोटीन gp120 या गैर विशिष्ट मुख्यमंत्री प्रोटीन की बढ़ती मात्रा के साथ incubated रहे थे. बाध्यकारी प्रतिक्रिया मिश्रण एक जेल गतिशीलता बदलाव परख द्वारा विश्लेषण किया गया. Aptamer A-1 और बी 68 लक्ष्य प्रोटीन के साथ सबसे अच्छा बंधन आत्मीयता से पता चला है, लेकिन मुख्यमंत्री नहीं प्रोटीन. डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं चार के औसत प्रतिकृति. (बी) एक जेल शिफ्ट परख से बाध्यकारी वक्र.

चित्रा 4
चित्रा 4: सेल प्रकार विशिष्ट बंधनकारी और aptamers के तेज अध्ययन. (ए) Cy3 लेबल RNAs के सेल सतह बंधन प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था. Cy3 लेबल RNAs चो - gp160 कोशिकाओं और चो ई नियंत्रण कोशिकाओं के लिए बाध्य करने के लिए परीक्षण किया गया. चयनित aptamers सेल प्रकार विशिष्ट बंधनकारी आत्मीयता दिखाया. 2 एन डी आरएनए पूल और अप्रासंगिक RNAs नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं तीन की औसत प्रतिकृति. (बी) internalization विश्लेषण. चो - gp160 कोशिकाओं 35 मिमी प्लेट में बड़े हो रहे थे और एक 100 एनएम के वास्तविक समय रहते सेल confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए संस्कृति मीडिया में A-1 Cy3 लेबल की एकाग्रता के साथ incubated. छवियों को 15 मिनट में एकत्र किए गए थे. 40x बढ़ाई अंतराल का उपयोग करते हुए. (सी, डी) स्थानीयकरण विश्लेषण. चो gp160 कोशिकाओं और चो ई नियंत्रण कोशिकाओं 35 मिमी प्लेट में बड़े हो रहे थे. A-1 Cy3 - लेबल की 100 एनएम के साथ ऊष्मायन इससे पहले, कोशिकाओं Hoechst 33342 (जीवित कोशिकाओं के लिए परमाणु डाई) के साथ दाग थे और तब वास्तविक समय confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विश्लेषण. (ई) चयनित विरोधी gp120 aptamers मानव पहले से एचआईवी -1 NL4-3 वायरस से संक्रमित PBMCs में एचआईवी -1 प्रतिकृति रोकना . विभिन्न सांद्रता और समय pointes प्रस्तुत किए गए. IC50 मूल्य सूचीबद्ध किया गया. डेटा p24 की तीन प्रतियों माप के औसत का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 5
चित्रा 5: और aptamer siRNA कल्पना वितरण प्रणाली के डिजाइन और मूल्यांकन . (क) योजनाबद्ध aptamer siRNA chimeric RNAs: विरोधी gp120 aptamer के क्षेत्र gp120 करने के लिए बाध्य है और siRNA एचआईवी-1 गूंथना / राजस्व का एक आम एक्सॉन को लक्षित कर रहा है के लिए जिम्मेदार है. भावना 2'Fluoro संशोधित aptamer siRNA एकल भूग्रस्त सह लिखित था, पूरक siRNA antisense कतरा chimeric अणु को पूरा करने के लिए annealing द्वारा पीछा किया. Aptamer और siRNA के बीच एक linker (UU) हरे रंग में संकेत दिया है. (बी) aptamer - siRNA chimeric RNAs कि तुलनीय केडी मान के रूप में पैतृक aptamers के रूप में अच्छी तरह से है विशेष रूप से एचआईवी बाल gp120 प्रोटीन बाँध. डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं तीन की औसत प्रतिकृति. (सी) सेल प्रकार aptamers की विशिष्ट बंधनकारी अध्ययन. Cy3 लेबल RNAs चो - gp160 कोशिकाओं और चो ई नियंत्रण कोशिकाओं के लिए बाध्य करने के लिए परीक्षण किया गया. सेल सुरCy3 - लेबल हुए RNAs के चेहरे बाइंडिंग प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया. चयनित aptamers सेल प्रकार विशिष्ट बंधनकारी आत्मीयता दिखाया. 2 एन डी आरएनए पूल और अप्रासंगिक शाही सेना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. डेटा का प्रतिनिधित्व दो की औसत प्रतिकृति. (डी, ई) internalization और intracellular स्थानीयकरण विश्लेषण. चो - gp160 कोशिकाओं 35 मिमी प्लेट में बड़े हो रहे थे और Hoechst 33342 (जीवित कोशिकाओं के लिए परमाणु डाई) के साथ दाग थे. बाद में, सेल संस्कृति के माध्यम में वास्तविक समय रहते सेल confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के रूप में पहले वर्णित के लिए कल्पना Cy3 लेबल 100 एनएम एकाग्रता के साथ incubated रहे थे.

चित्रा 6
चित्रा 6: एचआईवी-1 aptamer siRNA chimeras द्वारा मध्यस्थता संक्रमण की दोहरी निषेध. दोनों विरोधी gp120 aptamer और aptamer siRNA chimeras (ए) CEM कोशिकाओं (IIIB तनाव) में एचआईवी -1 संक्रमण निष्प्रभावी और (बी) मानव PBMCs (बाल तनाव) संस्कृति, क्रमशः. डेटा p24 की तीन प्रतियों माप के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. chimeras aptamer मजबूत की तुलना में अकेले निषेध संकेत दिखाया है कि (सी, डी) नीचे विनियमित / गूंथना राजस्व PBMCs में जीन की अभिव्यक्ति aptamers द्वारा दिया siRNA . डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं तीन की औसत प्रतिकृति.

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Discussion

Aptamers में इन विट्रो न्यूक्लिक एसिड होता है जो विशिष्ट और स्थिर तीन आयामी आकार को लगता है विकसित किया है, जिससे अत्यधिक विशिष्ट, लक्षित 8 अणुओं के लिए तंग बाध्यकारी प्रदान. कम nanomolar बंधन आत्मीयता और अपने लक्ष्य के लिए aptamers के उत्तम विशिष्टता के निदान के लिए उन्हें बहुमुखी उपकरण vivo इमेजिंग, और 9 चिकित्सा विज्ञान में, बनाते हैं. लक्षित siRNA वितरण के लिए aptamer प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ यह अब aptamer रिसेप्टर 10-12 siRNAs की मध्यस्थता endocytosis के लिए बाध्यकारी समारोह का उपयोग करने के लिए संभव है. झिल्ली रिसेप्टर्स के खिलाफ उठाया Aptamers होनहार वितरण वाहनों के रूप में उभरा है एक सेल प्रकार विशिष्ट तरीके से 13 है, जो चिकित्सीय प्रभावकारिता बढ़ाने कर सकते हैं में एक विशिष्ट रोग या ऊतक लक्ष्य के रूप में अच्छी तरह के रूप में अवांछित दवाओं के जहरीले साइड इफेक्ट को कम.

अब तक, aptamers लक्ष्य है कि एक विशिष्ट कक्ष या घातक कोशिकाओं के प्रकार subpopulation सफलतापूर्वक पृथक किया गया है और या तो पारंपरिक शुद्ध प्रोटीन आधारित SELEX या बरकरार सेल आधारित SELEX प्रक्रियाओं झिल्ली के माध्यम से विशेषता के एक बढ़ती हुई संख्या. सेल विशिष्ट घर वापस आना एजेंट के रूप में नए aptamers के कुशल पीढ़ी अभी भी एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है जब वांछित रिसेप्टर, अस्थिर देशी और समस्याग्रस्त जैव रासायनिक या भौतिक गुणों प्रजातियों की अनुपलब्धता के कारण पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ चयन प्रदर्शन. इसलिए, सेल आधारित SELEX aptamers है कि विशेष रूप से एक विशेष लक्ष्य सेल की आबादी के लिए बाध्य कर सकते हैं की पीढ़ी के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. हालांकि, यह देखा गया है कि मृत कोशिकाओं को हमेशा nucleic एसिड गैर विशिष्ट बंधनकारी उठाना, इसलिए सेल SELEX विफलता के कारण. इसके अलावा, सेल SELEX प्रक्रिया के लिए परंपरागत शुद्ध प्रोटीन आधारित SELEX, जटिलता और कक्षों की विविधता के साथ इसके विपरीत में भी कठिनाइयों में वृद्धि की सतह. इस प्रकार अब तक, लक्षित वितरण के लिए सेल विशेष aptamers सबसे शुद्ध प्रोटीन आधारित SELEX विधि का उपयोग करके विकसित किया गया है.

Aptamers के अलगाव के लिए उन पारंपरिक रणनीतियों के अलावा, nitrocellulose झिल्ली आधारित SELEX अच्छी तरह से स्थापित है और कई प्रकाशनों में प्रलेखित है. इस के साथ साथ, हम इस प्रक्रिया को रोजगार के लिए सफलतापूर्वक कई नए विरोधी एचआईवी gp120 आरएनए aptamers, जो के लिए विशेष रूप से gp120 बाँध कर रहे हैं और एचआईवी लिफाफा व्यक्त कोशिकाओं में भली भाँति अलग. और एक ठोस चरण (जैसे: मोती, राल स्तंभ, थाली या चिप) sorbent लक्ष्य पर स्थिर है, जो नहीं: इस तकनीक के फायदे में से एक के रूप में, यह लक्ष्य अणुओं (प्रोटीन उदाहरण के लिए) को संशोधित करने के लिए आवश्यक नहीं है 'लक्ष्य मूल पुष्टि प्रभावित. यह और अधिक विश्वसनीय और चयन के लिए सरल है. आदेश में उच्च आत्मीयता के साथ बाध्य शाही सेना प्रजातियों को समृद्ध करने के लिए, चयन तंगी ध्यान से चयन बफर प्रणाली, लक्ष्य प्रोटीन, प्रतियोगी tRNA और वाशिंग 8 बार की एकाग्रता के रूप में इस तरह की स्थितियों, समायोजन करके नियंत्रित किया जाता है. चयन के दौरान, बंधन आत्मीयता यकीन है कि संवर्धन और चयन की प्रगति, जिससे अगले चयन दौर के लिए हालत ठीक ट्यूनिंग बनाने के लिए नजर रखी है. इन aptamers के कई अलग अलग उपभेदों एचआईवी -1 बाधित है, कि विरोधी gp120 aptamers है कि gp120 और CD4 रिसेप्टर के बंधन को अवरुद्ध करके एचआईवी एक प्रविष्टि के प्रारंभिक कदम को बाधित संकेत एचआईवी एक चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उपयोगी हो सकता है सकते हैं. हम भी एक gp120 aptamer के उत्तम विशिष्टता पर भुनाने के लिए शुद्ध परिणाम के साथ एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं में एचआईवी रोधी siRNAs कि प्रतिकृति और एचआईवी के प्रसार की जोरदार aptamer और एक siRNA लक्ष्यीकरण गूंथना / राजस्व की संयुक्त कार्रवाई से हिचकते है उद्धार एचआईवी 1 7 के आम एक्सॉन, 14. इसलिए, विरोधी gp120 aptamers दोनों antiviral एजेंट के रूप में और siRNA वितरण अभिकर्मकों के रूप में कार्य कर सकते हैं.

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Disclosures

जे आर और JZ "सेल प्रकार विशिष्ट aptamer siRNA एचआईवी -1 उपचार के लिए वितरण प्रणाली" पर एक पेटेंट लंबित है. यूएसपीटीओ, नहीं

Acknowledgments

हम Britta Hoehn, Guihua सन, हैरिस Soifer और उपयोगी विचार - विमर्श के लिए लिसा Scherer धन्यवाद. चो - ई और चो - gp160 सेल: यह काम NIH एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम एड्स के प्रभाग, NIAID, एनआईएच के माध्यम से प्राप्त थे AI29329 स्वास्थ्य और HL07470 निम्नलिखित अभिकर्मकों JJR करने के लिए सम्मानित किया के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था रेखा; pNL4-3 ल्यूक वेक्टर, एचआईवी -1 से gp120 बाल DAIDS, NIAID.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MF-Millipore membrane filter EMD Millipore HAWP01300 Pore size 0.45 μm
Swinnex Filter holder EMD Millipore SX0001300 13 mm diameter
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706 DNA purification
Microcon YM-30 column EMD Millipore 42410 RNA concentration
Bio-spin 30 column Bio-Rad 732-6250 RNA purification
Taq PCR DNA polymerase Sigma-Aldrich D1806
ThermoScript RT-PCR system Invitrogen 11146-024
DuraScribe T7 transcription Kit Epicentre Biotechnologies DS010925
dNTP for PCR Roche Group 1 581 295
Ribonucleic acid, transfer from E.coli Sigma-Aldrich R1753 tRNA competitor
HIV-1Ba-L gp120 protein National Institutes of Health 4961 Target protein
Silencer siRNA labeling kit - Cy3 Ambion 1632
Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) Ambion AM9720
Chloroform/Isopropanol 24/1 solution Sigma-Aldrich C0549
Calf intestinal phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290L
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201L
Glycogen Roche Group 10 901 393 001 RNA precipitation
Gamma-P32-ATP MP Biomedicals 013502002 Radiactivity
40% AccuGel 19:1 National Diagnostics EC-850
10xTBE National Diagnostics EC-860
N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) Sigma-Aldrich T9281
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
L-methioine sulfoximine Sigma-Aldrich M5379-250 mg
RPMI Media 1640 Invitrogen 11835-030
Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v Invitrogen 25080-094
Minimum Essential Medium (MEM) (10') Invitrogen 11430-030
MEM non-essential amino acid (100') Invitrogen 11140-050
TA cloning kit with pCR 2.1 Invitrogen K2040-01

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References

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इम्यूनोलॉजी 52 अंक (सिस्टमेटिक घातीय संवर्धन द्वारा ligands का विकास) SELEX शाही सेना aptamer एचआईवी-1 gp120 आरएनएआई (शाही सेना हस्तक्षेप) siRNA (छोटे दखल शाही सेना) सेल प्रकार के विशिष्ट प्रसव
सेल प्रकार विशिष्ट siRNA वितरण के लिए विरोधी एचआईवी gp120 aptamers का विकास
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Zhou, J., Li, H., Zhang, J., Piotr,… More

Zhou, J., Li, H., Zhang, J., Piotr, S., Rossi, J. Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery. J. Vis. Exp. (52), e2954, doi:10.3791/2954 (2011).

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