نحن هنا وصف مجموعة من فحوصات الحمض النووي الطفرة التي يمكن دمجها مع نموذج الخميرة عمر زمني لدراسة الجينات / المسارات التي تنظم أو تساهم في عدم الاستقرار الجيني DNA أثناء الشيخوخة.
وقد كشفت الدراسات باستخدام نموذج الجعوية السكيراء مسارات عمر الشيخوخة التنظيمية التي يتم حفظها جزئيا في أعلى حقيقيات النوى 1-2. ويمكن أيضا البساطة وقوة النموذج الخميرة الشيخوخة يمكن استكشافها لدراسة الحمض النووي من التلف والصيانة الجينوم فضلا عن مساهماتها في الأمراض أثناء الشيخوخة. هنا ، نحن تصف نظام لدراسة الطفرات الحمض النووي التي تعتمد على سن ، بما في ذلك استبدال القاعدة ، والطفرات الإطار التحول ، إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالي ، ومثلي / homeologous إعادة التركيب ، فضلا عن النشاط النووي إصلاح الحمض النووي من خلال الجمع بين الحياة تمتد زمنيا الخميرة مع الحمض النووي بسيطة الضرر والمقايسات الطفرة. وينبغي أن الأساليب المذكورة هنا تسهيل التعرف على الجينات / المسارات التي تنظم عدم الاستقرار الجيني والآليات التي تكمن وراء الطفرات الحمض النووي التي تعتمد على العمر والسرطان في الثدييات.
السائل ثقافات الشيخوخة في وقت ما يحمل إعادة نمو / النمط الظاهري يلهث 13 ، مما يعقد التحليل CLS. إعادة نمو يحدث عادة عندما يكون أكثر من 90-99 ٪ من السكان قد فقدت قدرتها على البقاء. وكثيرا ما يرتبط هذا النمط الظاهري مع الاكسدة زيادة و / أو حماية انخفض في الخلية. على سبيل المثال ، وتواتر هذا النمط الظاهري أكثر من الضعف في الخلايا التي تفتقر عصاري خلوي ديسموتاز الفائق ويقلل إلى حد كبير في المسوخ طويلة الأمد (على سبيل المثال ، أو sch9 Δ Δ ras2) أو المسوخ overexpressing الفائق dismutases 22. في الممارسة العملية ، نحدد إعادة النمو وزيادة في البقاء أو تحقيق الاستقرار في البقاء لمدة 3 عينات متتالية في مرحلة الشيخوخة وفيات مرتفعة خلال الزمني.
السن التي تعتمد على ترددات مختلفة من الطفرات الحمض النووي اعتمادا كبيرا على خلفية توتر ، والتلاعب الجيني ، والظروف والثقافة ، فضلا عن إعادة نمو يلهث / والبقاء على قيد الحياة ضئيلة جدا. وينبغي القيام بها قبل التجارب في نقطة زمنية مثل يعني بقاء والحد الأقصى لكثافة مع الطلاء المختلفة لفحوصات لتحديد الطفرة طفرة مدى التردد قبل تحليل performingthe النطاق الكامل مدى الحياة. وينبغي دائما نوع السلالة البرية ستدرج في فترة الطفرة الحياة أو تردد في دراسة موازية لأية معاملة أو متحولة الوراثية ، بحيث يمكن أن تمثل ما بين التجربة ، عن الاختلافات. وينبغي أن تدرج المقلدة بيولوجية متعددة في الدراسة ؛ والسائل على حد سواء ، والبقاء في المقايسات / الطفرة الموضع ينبغي القيام بها لتأكيد النتائج.
بدلا من التركيز على نوع واحد محدد من تحور الحمض النووي ، والتنميط من عدم الاستقرار الجيني العمرية التي تعتمد على استخدام فحوصات متعددة في تركيبة ، قد تسلط الضوء على أضرار الحمض النووي DNA محددة ونظام إصلاح الأضرار (ق) التي تسهم في عدم الاستقرار الجيني التي تعتمد على سن. على سبيل المثال ، يلاحظ وجود زيادة كبيرة في إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالي (GCRs) ، بالمقارنة مع تلك الطفرات الحمض النووي الأخرى ، ونوع الخميرة البرية يشير إلى وجود كسر elevationof حبلا ضعف و / أو الانخفاض. مثلي في غير الغاية الانضمام (NHEJ) خلال الخميرة ترتيب زمني الشيخوخة (الجدول 2). اقترح الطيف طفرة can1 (تسلسل الجين CAN1) تم الحصول عليها في الشيخوخة الخميرة البرية من نوع زيادة في الضرر التأكسدي خلال الشيخوخة الزمني وعرضة للخطأ إصلاح الحمض النووي ، في حين أنه ، في المدى عاش المسوخ Δ sch9 ، الحمض النووي من التلف التأكسدي وأقل ولوحظ انخفاض كبير في التوليف عرضة للخطأ translesion 20.
يمكن أن الأساليب المذكورة هنا أنفق إجراء مزيد من الدراسة التي تعتمد على سن عدم الاستقرار الجيني. على سبيل المثال ، يمكن عزل الخلايا هادئة وغير هادئة ، من ثقافات ثابتة المرحلة الخميرة باستخدام أسلوب التدرج الكثافة التي وصفها آخرون ألين 23. جنبا إلى جنب مع الطفرة المقايسات وصفها هنا ، لقد ذكرت لنا أن جزءا كبيرا من العمر التي تعتمد على الطفرات تنشأ من خلايا هادئة ، بدلا من الخلايا ، وتقسيم التالفة أو أفكارك 20،24.
The authors have nothing to disclose.
نشكر S. جينكس روبرتسون وHeidenreich هاء لتوفير البلازميدات وسلالات الخميرة ؛ لمساعدة مقايسة TLS withthe P. فام غودمان والقوة المتعددة الجنسيات. وأيد هذا العمل ، في جزء منه ، من قبل الاتحاد الاميركي لبحوث الشيخوخة ومنحة المعاهد الوطنية للصحة AG20642 ، AG025135.