在这里,我们描述了一套与酵母顺序寿命模型来研究基因/通路调节,或在衰老过程中作出贡献基因组DNA不稳定,可结合DNA突变检测。
使用酿酒酵母衰老模型的研究已发现的寿命是部分在高等真核生物 1-2中保守的调控途径。酵母衰老模型的简单性和力量,也可以探讨研究DNA损伤和基因组维修以及他们的贡献,在衰老过程中的疾病。在这里,我们描述了一个系统来研究年龄相关的DNA突变,包括碱基置换,移码突变,染色体重排总值,并同源/ homeologous重组,以及通过简单的DNA相结合的酵母顺序寿命核DNA修复活性损伤和突变检测。这里所描述的方法应便于识别基因/途径调节基因组的不稳定和机制的基础在哺乳动物中年龄依赖性的DNA突变与癌症。
液体老化文化的某个时候表现出的再生/喘气表型的13,其中的华彩分析的复杂性。愈合,通常会出现超过90-99%的人口已经失去了可行性。这种表型往往与增加氧化应激和/或降低保护细胞。例如,这种表型的频率超过在缺乏胞质超氧化物歧化酶的细胞双打,并大大降低了在长寿的突变体 (例如,sch9Δ或ras2Δ)或22突变体的过度表达超氧化物歧化酶。在实践中,我们定义为增加可行性或稳定在3连续采样在时间顺序老化,死亡率高阶段的可行性再生。
年龄相关的不同的DNA突变频率差异很大,取决于应变的背景下,遗传操纵,文化条件,以及再生/喘气和极低的生存。应进行预实验,在时间点,如与突变检测的各种电镀密度平均和最大的生存前performingthe满刻度的寿命分析,以确定突变频率范围。野生型菌株应始终包含在一个寿命或突变频率的研究,平行任何治疗或基因突变等实验间的变化可占。多种生物副本应包括在研究,液体和在应进行原位可行性/突变分析证实的结果。
而是把重点放在一个特定类型的DNA突变分析,组合使用多种检测年龄相关的基因组不稳定,可能揭示出特定的DNA损伤和DNA损伤修复系统(S),年龄相关的基因组不稳定。例如,在毛的染色体重排(GCRs)显著增加,比其他DNA突变的,是观察野生型酵母提示elevationof双链断裂和/或减值的非同源末端加入酵母期间(NHEJ)按时间老化(见表2)。 CAN1突变谱(CAN1的基因测序)在野生型老化酵母建议时间老化和容易出错的DNA修复过程中的增加,而在长寿命sch9Δ突变体,少氧化DNA损伤和氧化损伤大大减少错误容易发生translesion合成观察20。
此处描述的方法可以进一步支出来研究年龄相关的基因组不稳定。例如,静态和非静态的细胞可以分离出酵母固定相使用密度梯度法Allen 等人所描述的文化23。这里所描述的基因突变检测相结合,我们曾报道,一大截的年龄相关的基因突变,从静态的细胞,而不是分割,损坏或细胞凋亡20,24,出现。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢提供质粒和酵母S. Jinks罗伯逊和E Heidenreich; P. Pham和中频古德曼帮助了与TLS的检测。这项工作是支持中的一部分,美国联邦和衰老研究补助金由NIH AG20642,AG025135。