Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Summary

Um método simples e rápido para determinar o potencial de sacarificação de um grande número de amostras de biomassa vegetal é descrito. A plataforma automatizada para esta análise envolve a preparação da biomassa de plantas para análise em 96 placas bem e do desempenho posterior de hidrólise pré-tratamento e quantificação dos açúcares liberados.

Abstract

Polissacarídeos que compõem a biomassa vegetal lignocelulósica pode ser dividido para produzir uma variedade de açúcares que posteriormente podem ser utilizados no estabelecimento de uma biorefinaria. Essas matérias-primas que constituem uma nova plataforma industrial, que seja sustentável e carbono neutro, para substituir a actual dependência de combustíveis fósseis. A recalcitrância à desconstrução observado em materiais lignocelulósicos é produzido por várias propriedades intrínsecas das paredes celulares das plantas. Celulose cristalina é incorporado na matriz de polissacarídeos, tais como xilanas e arabinoxilanos, e toda a estrutura é envolto pela fenólicos polímero da lignina, que também é difícil de digerir ^1. A fim de melhorar a digestibilidade dos materiais vegetais precisamos descobrir os principais gargalos para a sacarificação das paredes das células e também mutante tela e populações reprodutoras para avaliar a variabilidade na sacarificação ^2. Estas tarefas requerem uma abordagem de alto rendimento e aqui apresentamos uma plataforma analítica que pode realizar a análise sacarificação em um formato placa de 96 poços. Esta plataforma foi desenvolvida para permitir o rastreamento de digestibilidade da lignocelulose de grandes populações de espécies de plantas variadas. Nós temos reduzido os volumes de reação para pré-tratamento gentil, hidrólise enzimática parcial de açúcar e determinação, para permitir que um grande número de ser avaliado rapidamente em um sistema automatizado.

Esta plataforma automatizada trabalha com quantidades de miligramas de biomassa, realizando moagem, sob condições controladas para reduzir os materiais vegetais a uma granulometria padronizada de forma reproduzível. Depois que as amostras são moídas, o robô automatizado dispensa a formatação quantidades especificadas e registradas de material nos poços correspondentes da placa de 96 poços profundos (Figura 1). Normalmente, nós dispensar o mesmo material em 4 poços de ter 4 repetições para análise. Uma vez que as placas são preenchidos com o material vegetal no layout desejado, eles são movidos manualmente para uma estação de manipulação de líquidos (Figura 2). Nesta estação as amostras são submetidas a um pré-tratamento leve com um ácido diluído ou alcalina e incubadas a temperaturas de até 90 ° C. A solução de pré-tratamento é posteriormente removida e as amostras são lavadas com tampão para devolvê-los a um pH adequado para a hidrólise. As amostras são então incubados com uma mistura de enzimas por um período de tempo variável, a 50 ° C. Uma alíquota é retirada do hidrolisado e os açúcares redutores são automaticamente determinados pelo método colorimétrico MBTH.

Protocol

1. Preparação das amostras Nós normalmente trabalham com hastes de qualquer herbáceas ou plantas lenhosas. No caso de materiais de herbáceas que crescem as plantas até o vencimento, e após o desenvolvimento da semente que coletamos hastes seco uma vez a senescência está completa. As hastes são cortadas em quatro segmentos mm e colocadas em 2 frascos ml com três bolas de moagem. No caso de materiais lenhosos, as amostras são moídas para serragem grossa de madeira com um arquivo do curso e, em seguida, colocada em um moinho de bolas para processamento posterior. As amostras são colocadas em um rack dentro da moagem / formatação estação (Figura 1). Esta estação seqüencialmente grinds, mixagens, e pesa cada amostra. O número de repetições necessárias por amostra é estabelecida pelo teste do material moído em uma série de experimentos preliminares em que a variabilidade intrínseca para um tamanho de partícula certo é determinada. Os 2 mL são perfurados na parte inferior e os materiais são dispensados ​​pela vibração do frasco sobre o bem selecionado. O braço oscilante é controlado por um feedback de equilíbrio que permite a distribuição exata do pó. O robô dispensa 4 mg / poço em uma análise standard e 4 repetições são necessários na maioria dos casos. Isto permite que 20 amostras de plantas / placa a ser analisado. 2. Pré-tratamento Depois que as amostras são formatados, as placas de 96 poços são processadas por um sistema automatizado líquido de manejo (Figura 2). Aqui, um pré-tratamento é realizado em leve os materiais vegetais, adicionando 350 mL de ácido ou soluções alcalinas e aquecimento da placa em um bloco adaptado. Para evitar evaporação durante a análise, os 96 pratos são bem selado com um mate silicone. A temperatura eo tempo de pré-tratamento pode ser modificado de acordo com os materiais em estudo. A temperatura máxima, no entanto, é de 100 ° C. Um procedimento alternativo para o teste pré-tratamentos mais duras é para pré-tratamento dos materiais fora de linha e eliminar o pretreatmet do processo. 3. Hidrólise Após os materiais são pré-tratados, o robô automaticamente remove a solução de pré-tratamento e lavagens, todos os poços, 5 vezes com 850 mL tampão acetato 25 mM. Os enxaguatórios são realizadas pela adição de tampão à solução de pré-tratamento e, posteriormente, removendo 50% do volume total depois de permitir que os sólidos na amostra para resolver. A altura da aspiração é fixado em metade da massa de líquido para evitar a aspiração de sólidos do fundo do poço, não há perda desprezível de sólidos usando essa abordagem. Após estas lavagens do pH no poço é de 4,5 eo material está pronto para a hidrólise enzimática. Uma mistura de enzimas contendo uma solução de celulases e hemicelulases é adicionado pelo robô. Em cada poço, 850 mL da mistura de enzimas é dispensada ea placa é transferida para uma 50 ° C agitando incubadora. A hidrólise padrão é realizada por 8 h, mas desta vez pode ser adaptado para a finalidade do experimento. O carregamento da enzima padrão usado para gramíneas é de 7 FPU / g de material. 4. Detecção de açúcares redutores Determinação de açúcares redutores liberados após a hidrólise foi realizada utilizando uma versão modificada do 3-metil-2-benzothiazolinone zona hídrica método (MTBH) 3. MBTH foi selecionado como o método mais adequado, porque era mais fácil de automatizar e menos suscetível a interferência de tais compostos como proteínas. Nós modificamos este método altamente sensível para uso na plataforma robótica para que pudesse quantificar com precisão os açúcares nas concentrações presentes no hidrolisado de biomassa, com um volume final de 250 mL que é adequado para um padrão de 96 placa óptica bem. Todos os passos a seguir são executadas automaticamente e três determinações independentes dos açúcares redutores foram realizadas para cada reação sacarificação. 30 mL de hidrolisado foi retirado da placa de poço profundo e misturado com 45 mL de tampão acetato 25 mM de sódio em um contornou PCR placa de 96 poços. 25 mL de NaOH 1N e 50 ul de uma solução contendo 0,43 mg / ml MBTH e 0,14 mg / ml DTT foram adicionados. Após a mistura, a placa de PCR foi aquecida a 60 ° C por 20 min em um termociclador ou dispositivo similar que oferece exatamente a mesma quantidade de calor para todos os 96 poços. A reação resultante foi transferido para uma placa óptica. Adicionar 100 ul do reagente oxidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% de ácido sulfâmico e 0,1% HCl). Misture bem e deixe a desenvolver por pelo menos 1 h. Cada chapa deve conter também as reações padrão de 50 nmol, 100 e 150 nmol de glicose nmol. As placas ópticas são lidas a 620 nm. 5. Resultados representativos: Exemplos de diferentes tipos de análises são apresentados na figura 3 e 4. Todos os resultados foram obtidos utilizando a plataforma automatizada. Figura 3 reapresenta o aumento de açúcares redutores liberados por 8 h de incubação poplar terreno com quantidades crescentes de enzimas celulolíticas. A Figura 4 apresenta os efeitos do ácido e pré-tratamento alcalino em amostras de álamo. O pré-tratamento NaOH é mais eficiente que o pré-tratamento H2SO4 diluído em facilitar a liberação de açúcares durante a hidrólise. A quantidade de açúcares medidos após hidrólise diminui quando o pré-tratamento é realizado com concentrações superiores a NaOH 1M. Figura 1. Estação Robotic para moer e 96 de formatação bem de biomassa Figura 2. Estação de tratamento de líquido para a análise de Alto Rendimento sacarificação Figura 3. Efeito de cargas enzima diferente sobre a libertação de equivalentes redutores de açúcar a partir de amostras de álamo Figura 4. Açúcares Efeito de diferentes pré-tratamentos na sacarificação de amostras de álamo. A. liberado após pretreament com diferentes porcentagens de H2SO4 a 90 ° C por 30 minutos. Açúcares B. liberado após pré-tratamentos NaOH à mesma temperatura e tempo do que o pré-tratamento ácido .

Discussion

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.

A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination⁴.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Grinding & weighing robot	Labman Automation
2 ml micro tube with caps	Sarstedt Ltd	72.694
5 mm stainless steel beads	Qiagen Ltd	69989
1.2ml Abgene square well storage plates	Fisher Scientific Ltd	TUL-050-050C
Whatman cap mat for 96 square well plates	Fisher Scientific Ltd	7704-0104
Liquid hanling robot	Tecan Group Ltd.	Freedom Evo 200
Sulphuric acid	Fisher Scientific Ltd	S/9231/PB17
Sodium hydroxide	Fisher Scientific Ltd	BPE359-500
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750-500G
Acetic acid	Fisher Scientific Ltd	A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1.5L	Novozyme	CCN03122
96 well PCR full skirt plates	Sarstedt Ltd	72.1980.202
D-Glucose	Fisher Scientific Ltd	G/0450/53
3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	129739-25G
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9163-1G
Corning microplate 96 well flat bottom	Fisher Scientific Ltd	TKT-521-050H
Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate	Sigma-Aldrich	F1668-250G
Sulfamic acid	Sigma-Aldrich	242772-500G
Hydrochloric acid	Fisher Scientific Ltd	12462-0026