Summary
Brucelles plasmonique et nanostructures cristaux photoniques sont présentés à produire des améliorations utiles dans le contrôle de l'efficacité et l'orientation de piégeage optique des micro-et nano-particules.
Abstract
Une méthode pour manipuler la position et l'orientation des particules submicroniques non destructive serait un outil incroyablement utile pour la recherche biologique fondamentale. Peut-être la force la plus largement utilisée pour réaliser la manipulation physique non invasif de petites particules a été diélectrophorèse (DEP). 1 Cependant, DEP sur son propre manque de la polyvalence et la précision qui sont souhaités lors de la manipulation des cellules, car il se fait traditionnellement avec des électrodes fixes. Pinces optiques, qui utilisent une durée de trois dimensions du gradient du champ électromagnétique d'exercer des forces sur de petites particules, de réaliser cette polyvalence souhaitée et la précision. 2 Toutefois, un inconvénient majeur de cette approche est l'intensité du rayonnement élevées requises pour atteindre la force nécessaire pour piéger une particule qui peut endommager les échantillons biologiques 3 Une solution qui permet de piégeage et de tri avec une intensité moindre optiques sont optoélectroniques pincettes (OET), mais OET ont des limites à la manipulation fine de petites particules;.. étant DEP technologie basée met également contrainte sur la propriété de la solution 4 , 5
Cet article vidéo décrivent deux méthodes qui diminuent l'intensité du rayonnement nécessaire pour la manipulation optique des cellules vivantes et aussi de décrire une méthode pour le contrôle de l'orientation. La première méthode est une pince à épiler plasmonique qui utilisent une nanoparticule d'or aléatoire (AUNP) tableau comme un substrat pour l'échantillon comme dans la Figure 1. Le tableau AUNP convertit les photons incidents dans les plasmons de surface localisés (LSP) qui se composent de résonance moments dipolaires qui rayonnent et de générer un champ de rayonnement à motifs avec un gradient important dans la solution de cellules. Le travail initial sur les plasmons de surface améliorée piégeage par Righini et al et de notre propre modélisation ont montré les champs générés par le substrat plasmonique de réduire l'intensité initiale requise par l'amélioration du champ de gradient qui piège les particules. 6,7,8 L'approche plasmonique permet de bien contrôler l'orientation des particules ellipsoïdales et les cellules avec de faibles intensités optiques à cause de la conversion d'énergie plus efficaces optiques en énergie mécanique et un champ de rayonnement dipolaire-dépendante. Ces champs sont présentés dans la figure 2 et les intensités faibles piégeage sont détaillés dans les figures 4 et 5. Les principaux problèmes avec des pincettes plasmonique sont que le LSP générer une quantité considérable de chaleur et le piégeage est à seulement deux dimensions. Cette chaleur génère des flux de convection et thermophorèse qui peut être assez puissant pour expulser les particules submicroniques du piège de 9,10. La seconde approche que nous allons décrire est l'utilisation des nanostructures périodiques diélectriques à la lumière incidente dispersent de façon très efficace dans des modes de diffraction, comme le montre la figure 6 11. Idéalement, il faudrait rendre cette structure d'un matériau diélectrique pour éviter les problèmes de chauffage mêmes expérimentés avec les pincettes, mais plasmonique dans notre approche en aluminium revêtu de réseau de diffraction est utilisé comme une nanostructure unidimensionnelle diélectriques périodiques. Même s'il n'est pas un semi-conducteur, il n'a pas l'expérience de chauffage importants et efficacement les petites particules piégées avec des intensités faibles piégeage, comme le montre la figure 7. L'alignement des particules avec le substrat grille valide conceptuellement l'idée que un cristal photonique en 2-D pourraient permettre une rotation précise des particules non sphériques microns de taille 10. L'efficacité de ces pièges optiques sont augmentées en raison de l'amélioration des champs produits par les nanostructures décrites dans ce document.
Protocol
1. Au hasard de fabrication de nanoparticules tableau 8,10,12,14
- Le tableau est formé de nanoparticules de Au en créant d'abord un modèle qui est constitué d'une couche dense de sphères de latex adsorbées au hasard avec un diamètre moyen de 454 nm. Ceci est réalisé par évaporation d'or d'abord sur une lamelle de verre d'une épaisseur de 20 nm à l'aide de chrome comme couche d'adhérence.
- La monocouche sphère en polystyrène est alors auto-assemblés en exposant le substrat recouvert d'or à un mélange de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), la suspension de latex et la sphère de l'eau déminéralisée.
- Le processus d'adsorption est autorisé à durer environ une heure et les sphères non absorbées sont emportés avec une grande quantité d'eau.
- La monocouche formé est séché à l'air.
- Enfin, un autre de 20 nm d'or est évaporée sur la monocouche sphère latex pour former le tableau d'or aléatoire des nanoparticules.
- Si une SEM est disponible, le tableau peut être vu AUNP sous la SEM pour ressembler à la figure 1 et un diagramme du processus est illustré à la figure 8.
2. Préparation des échantillons biologiques 9,11
- La préparation des échantillons pour des noyaux de cellules de souris optique piégeage est maintenant affichée.
- Noyaux de cellules 3T3 souris marqués à l'acridine orange colorant ont été obtenus à partir du groupe Tewari au Fred Hutchinson Cancer Research Center.
- 10% albumine sérique bovine (BSA) en tampon phosphate salin (PBS) est ajouté aux noyaux de cellules de souris à une concentration d'environ 1: 10 (BSA: les noyaux des cellules de la souris). Le BSA permet d'éviter les noyaux de coller au substrat.
- Mélanger la solution avec sonication.
- 5 uL de notre solution est déposé sur la lamelle en aluminium large réseau. Il est préférable d'effectuer cette étape avec le réseau d'aluminium sur la platine du microscope de sorte que vous n'avez pas à transporter l'échantillon après la solution est déposée.
- Deux piles de deux 1 "par une" lamelles sont utilisés pour soutenir une lamelle cinquième à laquelle l'échantillon est considéré.
- Position de l'échantillon au microscope pour le visionnement.
3. Méthode de piégeage
- Les pinces optiques sont construits par l'envoi d'un 35 mW d'hélium néon laser à travers un Imager.D1M Zeiss Axio équipé d'un ensemble de filtres GFP 17 qui est modifié pour permettre le rayonnement laser 633 nm pour atteindre l'échantillon.
- Un Zeiss LD EC Epiplan - Neofluar 50x objectif est utilisé pour l'image du noyau des cellules qui sont d'environ 5 microns de diamètre.
- Après l'échantillon est placé sous l'objectif, se concentrer au microscope sur la baie de nanoparticules d'or ou de réseau de diffraction.
- Traduire microscope verticalement jusqu'à ce point est effectuée sur les noyaux que vous le désir de piège.
- Spot laser sur la position piège à particules et les particules doivent alors maintenir sa position dans le spot laser, même lorsque la scène est traduite.
4. Les résultats représentatifs:
Les procédures aléatoires d'or nanoparticules tableau doit déposer une monocouche de AUNP qui peuvent être visualisées sous une SEM pour ressembler à la Figure 1. La force de piégeage créés par ces pinces plasmonique peut être 10-20 fois la force générée par la norme pinces optiques. Les intensités minimales requises par la pince à épiler plasmonique pour atteindre confinement des particules sont présentés pour des particules de différentes tailles dans la figure 4. 9,10 Le réseau de diffraction obtenu l'alignement et le piégeage avec 20 fois l'efficacité du piégeage élevé que le nanoplots or et pourrait atteindre le piégeage avec aussi peu que 17 uW / um 2 (figure 7). 11
Figure 1 10 (a) Micrographie MEB des nanoparticules d'or auto-assemblés. Le diamètre des nanoparticules d'or individuelles est d'environ 450 nm. L'image SNOM (b) de la plasmonique substrat où la distribution des nanoparticules est clairsemée, en montrant le rayonnement de champ proche. La longueur d'onde du laser d'excitation est 633 nm. (C) Vue à fort grossissement de la zone marquée avec le carré rouge en (b). (D) spectre d'efficacité de diffusion du substrat plasmonique, montrant le pic à 624 nm. (E) spectre d'efficacité d'absorption du substrat plasmonique, montrant le pic à 668 nm.
Figure 2 13 (a) Au nanosphères distribuées au hasard sur un domaine 2D 1 x 1 um 2. Chaque point bleu représente le centre de la nanosphère (a = 60 nm). Distributions de champ de diffusion sur avions d'observation qui sont parallèles à la baie de nanosphère aléatoire sont présentés dans (b) - (e). Le tableau nanosphère est uniformément éclairé par une onde plane à la longueur d'onde de 540 nm. L'indice de réfraction du milieu environnant est de 1,33. La Polala direction risation des points onde plane le long de l'axe X (horizontal (a)). L'ampleur du champ incident électrique est supposé être une dans le calcul. La séparation entre le plan d'observation et le tableau est défini comme nanosphère h. b) h = a. c) h = 2a. d) h = λ. e) h = 2λ.
Figure 3 9 Schéma de la configuration du microscope à fluorescence personnalisé incluant un filtre d'excitation et d'un court-circuité dichroïque remplacé séparateur de faisceau. Ceci est la configuration utilisée pour le piégeage simultanée et l'imagerie de fluorescence.
Figure 4 10 L'intensité du laser minimum pour maintenir le piège en fonction du débit de fluide entourant l'utilisation piégeage plasmonique. Toutes les intensités optiques sont mesurées à l'avion échantillon sous l'objectif du microscope. (A) - (f) montrent les résultats de mesure pour des billes de polystyrène avec un diamètre de 7,3 seule, 6,3 (non sphérique), 5,0, 3,9, 2,5 et 1,1 um, respectivement. Les cartons montrent les images correspondantes de particules microscopiques. Les barres d'échelle dans toutes les images représentent 5 um de longueur.
Figure 5 10 La pente de la droite d'ajustement passant par l'origine dans la Fig. 4 versus la taille des particules pour le piégeage plasmonique. Les barres d'erreur indiquent les déviations standard de l's'adapte linéaire. La pente de la droite d'ajustement (rapport entre le seuil d'intensité optique et débit) dans la Fig. 4 a une relation approximativement linéaire avec la taille des particules comme le montre cette figure, indiquant l'avantage de piégeage plasmonique surtout pour les petites particules.
Figure 6 11 (a) Schéma du piégeage optique améliorée en utilisant 1-D des nanostructures périodiques. Le faisceau incident est diffracté par la nanostructure périodique au champ lointain. (B) La distribution de l'intensité de la lumière avec deux polarisations orthogonales nanostructure au champ lointain. (B) La distribution de l'intensité de la lumière avec deux polarisations orthogonales à la surface d'un caillebotis en aluminium avec une période de 417 nm obtenue en utilisant des simulations FDTD. La distribution est normalisée à l'intensité sur une surface plate en aluminium. (C) et (d) le potentiel de piégeage des particules directement au-dessus la surface du réseau par rapport emplacement de la particule pour (c) un polystyrène de 350 nm de perles et (d) un polystyrène 1 um perle. Les cercles blancs montrent les tailles des particules. Des cartons intérieurs montrent le potentiel piégeage dessus d'une surface plate en aluminium pour la même granulométrie que les comparaisons. Les valeurs sont normalisées pour chaque taille de particule. Pour tous les chiffres de simulation FDTD le champ de vision est de 10 x 8 um 2.
Figure 7 11 (a) l'efficacité du piège et l'intensité minimale mesurée pour le piégeage des billes de polystyrène de différentes tailles avec polarisation perpendiculaire à la poutre lignes du réseau. Encart piège montre l'asymétrie dans l'efficacité du piégeage pour traduire une perpendiculaire 3,87 um perles en polystyrène et en parallèle aux règles de la grille. La ligne solide (grande asymétrie) est obtenu avec la lumière incidente polarisée perpendiculairement à la grille, et la ligne de trait (petite asymétrie) est obtenue avec la lumière incidente polarisée parallèlement au grillage. L'appareil est en (pN [mW / um 2] -1). (B) - (d) la démonstration de piégeage d'une lampe fluorescente 590 nm polystyrène perle. Le cercle rouge indique la position du spot laser comme la lumière du laser a été trop faible pour être vu. Au début, la particule est piégée dans l'endroit à plus haute puissance, comme la puissance est baissé, le mouvement brownien de la particule dépasse la force du piégeage, la particule permettant d'échapper. (E) - démonstration de piégeage (g) d'un noyau de la cellule du cancer ovarien fluorescentes. L'intensité minimale requise pour initier le piégeage a été de 16 uW / um deux obtenus à l'aide d'une lentille 20x objectif.
Figure 8 14 procédé de fabrication des nanoparticules d'or en forme de chapeau: une évaporation) de la couche de Cr et Au mince sur la lamelle de verre. b) Exposition à la suspension sphère de polystyrène et d'adsorption des sphères pendant 1 heure. c) Retrait de sphères de polystyrène non adsorbées et le séchage de la surface. d) l'évaporation d'une autre couche de Au-dessus des sphères modèle. e) Schéma de la matrice en forme de chapeau de nanoparticules de Au, où Au ne couvre que la partie supérieure de la sphère modèle.
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Discussion
L'importance de ces méthodes de piégeage est qu'ils diminuent l'intensité optique nécessaires pour le piégeage soutenue de quelque part sur l'ordre de 10 3 uW / um de 2 à quelque part sur l'ordre de 10 uW / um 2. 10,11 Les limitations de ces techniques sont que le tableau de nanoparticules d'or les expériences de chauffage des questions qui doivent être surmontés. Pour surmonter ce problème, une structure cristalline 2D photoniques qui est composé d'un matériau diélectrique peuvent être utilisés. Une telle structure pourrait théoriquement produire piégeage à de faibles intensités optiques et le contrôle des micro-et nano-particules de rotation et la position de manière précise en contrôlant la polarisation d'entrée. Les résultats caillebotis en chiffres 6 et 7 montrent que cela est vrai pour le cas 1D. La prochaine étape serait de créer un cristal photonique 2D et démontrer un cristal photonique large pince qui faciliterait beaucoup d'applications de recherche biologique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons également à remercier Xiaoyu Miao et Ben Wilson pour le développement le plus des méthodes décrites à l'intérieur. Ce travail a été financé par la National Science Foundation (DBI 0.454.324) et le National Institute of Health (R21 EB005183) et par PHS NRSA T32 GM07270 partir NIGMS d'ECK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Company | Catalog Number | Comment |
| Axio Imager Microscope (D1M) | Carl Zeiss, Inc. | D1M | Zeiss Axio Imager.D1M |
| Microscope Objective (50x/0.55) | Carl Zeiss, Inc. | LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x/0.55 HD DIC | |
| Zeiss Microscope Camera (AxioCam MRc) | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Helium Neon Laser (35 mW) | Research Electro-Optics | ||
| Continuously Variable Attenuator | Thorlabs Inc. | NDC-100C-4M | For adjusting microscope intensity |
| Zeiss Filter Set #17 | Carl Zeiss, Inc. | 488017-9901-000 | Filter Set #17 |
| Microscope Slides, 0.5 mm thickness | VWR international | ||
| 3T3 mouse cell nuclei | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Store as cold as possible | |
| Acridine Orange dye | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| Bovine Serum Albumin, 1 to 10 ration in PBS | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| 454 nm polystyrene latex spheres | Polysciences, Inc. | ||
| carbodiimide hydrochloride (EDC) - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) | G-Biosciences | BC25-1 | |
| gold (for deposition) | |||
| Reflective ruled diffraction grating | Edmund Scientific | ||
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190-144 |
References
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