Meting van cytosolische Ca 2 + In geïsoleerde contractiele lymphatische

Summary

We introduceren een benadering van de cytosolische Ca evalueren^{2 +} Concentratie in geïsoleerde lymfevaten te bestuderen Ca^{2 +}-Afhankelijke-en Ca-^{2 +} Sensibiliserend mechanismen van lymfatische gladde spiercontractie.

Abstract

Lymfevaten bevatten een multifunctioneel transport systeem dat vloeistof homeostase onderhoudt, levert lipiden naar de centrale circulatie, en fungeert als een systeem van toezicht voor de potentieel schadelijke antigenen, het optimaliseren van mucosale immuniteit en adaptieve immuunreacties ^1. Lymfe is gevormd uit interstitiële vloeistof die blind-ended initiële lymfevaten komt, en dan wordt getransporteerd tegen een druk gradiënt in grotere lymfevaten verzamelen. Elke verzamelen van lymfatische is opgebouwd uit een reeks van segmenten genoemd lymphangions, gescheiden door premolaren kleppen die terugstroming te voorkomen. Elke lymphangion beschikt over een contractiele cyclus die lymfe tegen een druk gradiënt in de richting van de centrale circulatie ² voortstuwt. Deze fasische contractiele patroon is analoog aan de hartcyclus, met een systolische en diastolische fasen, en met een lagere frequentie krimp ^4. Daarnaast, lymfatische gladde spieren genereert toon en displays myogene vernauwing en verwijding in reactie op de stijgingen en dalingen in de luminale druk, respectievelijk ^5. Een hybride van moleculaire mechanismen die zowel de fasische en tonische contractiliteit van de lymfevaten te ondersteunen zijn dus voorgesteld.

Samentrekking van de gladde spieren in het algemeen bij de cytosolische Ca ^{2 +-concentratie} ([Ca ^{2 +]} _i) plus gevoeligheid voor Ca ^{2 +,} van de contractiele elementen in antwoord op veranderingen in de omgeving rondom de cel ^6. [Ca ^{2 +]} _i wordt bepaald door de combinatie van de beweging van Ca ^{2 +} door middel van plasma membraan ligand of spanningsgevoelige Ca ^{2 +} kanalen en de vrijlating en opname van Ca ^{2 +} uit interne winkels. Cytosolische Ca ^{2 +} bindt aan calmoduline en activeert enzymen zoals myosine lichte keten (MLC) kinase (MLCK), die op zijn beurt fosforyleert MLC leidt tot actine-myosine-gemedieerde contractie ^8. Echter, de gevoeligheid van deze weg naar Ca <sup> 2 + kan geregeld worden door de MLC-fosfatase (meerlagenleidingsysteem) ^9. MLCP activiteit wordt gereguleerd door Rho kinase (ROCK) en de myosine fosfatase inhibitor proteïne CPI-17.

Hier presenteren we een methode om veranderingen te evalueren in [Ca ^{2 +]} _i loop van de tijd in geïsoleerde, perfusie lymfatische om Ca ^{2 +-afhankelijke} en Ca ^{2 +-sensibiliserende} mechanismen van lymfatische gladde spiercontractie te bestuderen. Met behulp van geïsoleerde rat mesenteriale het verzamelen van lymfevaten we stretch-geïnduceerde veranderingen bestudeerd in [Ca ^{2 +]} _i en contractiele activiteit. De geïsoleerde lymfatische model biedt het voordeel dat de druk, flow, en de chemische samenstelling van het bad oplossing kan strak worden gecontroleerd. [Ca ^{2 +]} _i werd bepaald door het laden van lymfevaten met de ratiometrische, Ca ^{2 +-bindende} kleurstof Fura-2. Deze studies zullen een nieuwe benadering van het bredere probleem van het bestuderen van de verschillende moleculaire mechanismen die reguleren fasischcontracties versus tonic vernauwing in lymfatische gladde spieren.

Protocol

1. Dieren Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Louisiana State University Health Sciences Center en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH publicatie No 85-12, herzien in 1996). Mannelijke Sprague-Dawley ratten (Charles River Laboratories, 270-350 g lichaamsgewicht wt) werden ondergebracht in een gecontroleerde temperatuur (22 ° C) en gecontroleerde verlichting (12:12 h licht donker cyclus) omge…

Discussion

Een nieuwe combinatie van methoden is gebruikt om intrinsieke pompen van lymfevaten te bestuderen. De mogelijkheid om gelijktijdig meten van veranderingen in [Ca ^{2 +]} _i en diameter in pompen lymfevaten zal zorgen voor studies van de relatieve bijdrage van Ca ^{2 +-afhankelijke} en Ca ^{2 +-sensibiliserend} signaal transductie in de algemene regeling met betrekking tot de lymfatische contractiele cyclus.

De lymfatische contractiele cyclus bestaat uit fasi…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.