מדידה של Cytosolic Ca 2 + ב lymphatics כויץ מבודד

Summary

אנחנו מציגים גישה להעריך את Ca cytosolic^{2 +} ריכוז lymphatics מבודדים ללמוד Ca^{2 +} תלויי Ca^{2 +}-רגישות מנגנוני התכווצות שריר חלק הלימפה.

Abstract

כלי הלימפה מהווים מערכת תחבורה רב תכליתיים המקיימת הומאוסטזיס נוזל, שומנים מספקת כדי זרימת המרכזית, ופועל כמערכת מעקב עבור אנטיגנים מזיקים, אופטימיזציה חסינות הרירית ונרכשת ^1. לימפה נוצר מן נוזל interstitial שנכנס עיוורת הסתיימה lymphatics הראשוני, ולאחר מכן מועבר כנגד מפל הלחץ lymphatics איסוף גדול יותר. לימפטי כל איסוף מורכב מסדרה של קטעים בשם lymphangions, מופרדים על ידי שסתומים המונעים backflow הטוחנת. Lymphangion כל בעל מחזור התכווצות המניע הלימפה נגד הפרש לחצים לקראת מחזור המרכזי ^2. דפוס זה התכווצות phasic משול מחזור הלב, עם סיסטולי ודיאסטולי שלבים, ועם ⁴ בתדר נמוך התכווצות. בנוסף, שריר חלק הלימפה יוצרת צליל ומציג התכווצות התרחבות myogenic ואניn בתגובה עליות וירידות בלחץ luminal, בהתאמה ^5. היברידית של המנגנונים המולקולריים התומכות הן contractility phasic טוניק של lymphatics מוצעים כך.

התכווצות של שריר חלק מוסדר בדרך כלל על ידי cytosolic Ca ^{2 +} ריכוז ([Ca ^{2 +]} _i) בתוספת רגישות Ca ^{2 +,} האלמנטים כויץ בתגובה לשינויים בסביבה המקיפה את תא ^6. [Ca ^{2 +]} _i נקבעת על ידי שילוב של תנועת Ca ^{2 +} דרך הממברנה הפלסמטית ליגנד או מתח מגודרת Ca ^{2 +} ערוצים שחרור ספיגת של Ca ^{2 +} מחנויות פנימי. Cytosolic Ca ^{2 +} נקשר calmodulin ומפעיל אנזימים כגון שרשרת אור שרירן (MLC) קינאז (MLCK), אשר בתורו phosphorylates MLC המוביל להתכווצות אקטין שרירן בתיווך ^8. עם זאת, הרגישות של מסלול זה Ca <sup> 2 + יכול להיות מוסדר על ידי phosphatase MLC (MLCP) ^9. פעילות MLCP מוסדר על ידי Rho קינאז (רוק) לבין מעכב phosphatase שרירן חלבון למדד 17.

כאן, אנו מציגים שיטה להערכת שינויים [Ca ^{2 +]} _i לאורך זמן, lymphatics מבודד perfused כדי ללמוד Ca ^{2 +} תלויות Ca ^{2 +} ו-רגישות מנגנוני התכווצות שריר חלק הלימפה. שימוש מבודד mesenteric עכברוש lymphatics איסוף למדנו למתוח-Induced שינויים [Ca ^{2 +]} _i ו התכווצות בפעילות. המודל הלימפה מבודד מציע את היתרון הזה, הלחץ הזרימה, את ההרכב הכימי של הפתרון אמבטיה ניתן לשלוט בחוזקה. [Ca ^{2 +]} _i נקבע על ידי טעינת lymphatics עם ratiometric, Ca ^{2 +} מחייב לצבוע Fura-2. מחקרים אלה יספקו גישה חדשה לבעיה רחבה יותר של חקר המנגנונים המולקולריים שונים המווסתים phasicהתכווצויות לעומת התכווצות בשריר טוניק הלימפה חלקה.

Protocol

1. בעלי חיים כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש ב מדינת לואיזיאנה האוניברסיטה למדעי הבריאות מרכז בוצעו בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום מס '85-12, מתוקנת 1996). זכר Sprague-Dawley חולדות (Charl…

Discussion

שילוב הרומן של שיטות הועסק ללמוד מהותי שאיבה של כלי הלימפה. היכולת למדוד בו זמנית שינויים [Ca ^{2 +]} _i ו בקוטר lymphatics שאיבה יאפשר מחקרים על התרומה היחסית של Ca ^{2 +} תלויות Ca ^{2 +} ו-רגישות מסלולי איתות במנגנון הכולל המסדירים את מחזור הלימפה התכווצות.

<p class="…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.