조직 문화에 대한 손상 소의 꼬리 척추 디스크의 준비
Summary
이 프로토콜은을 위해 장기 문화에 대한 coccygeal 소 척추 디스크 수확 기술을 보여줍니다<em> 체외에서</em> 장기 문화.
Abstract
척추 디스크 (IVD)는 척추에 척추를 연결하는 척추 관절입니다. 그것은 척추의로드를 전송하고 척추에 유연성을주는 기능을 수행합니다. 그것은 세 가지 구획의 작성할 : 환대 fibrosus (AF), 그리고 양쪽의 척추 기관에 NP와 AF를 연결하는 두 연골 endplates에 의해 포함한 내면 핵의 pulposus (NP)를. 아마도 퇴행성 척추 디스크 질환 (DDD)와 디스크 herniations에 의한 Discogenic 고통은 우리의 현대 사회의 주요 문제로 확인되었습니다. IVD 변성 가능한 메커니즘을 연구하기 위해, 라이브 디스크 세포로 체외 장기 문화 시스템에서 매우 매력적입니다. 그대로 소 coccygeal IVDs의 체외 문화가 잘 제어 생리학 및 기계적 환경에서 메카 – 생물 학적 측면의 연구를 수있는 관련 모델 시스템으로 고급하고 있습니다. 소의 꼬리 IVDs가 높은 숫자를 비교적 쉽게 구할 수 있습니다D 세포 밀도, 세포 인구 및 크기와 관련하여 인간의 허리 IVDs 매우 유사합니다. 영양 경로가 명백하게 응고된 피가에 의해 차단된 이후 단, 연골이 endplates 및 뼈다귀 endplates을 유지 이전 소 꼬리 IVD 수확 기술 문화 1-2 일 후에 실패했습니다. IVDs 가장 큰 avascular 장기 있으며, 따라서 NP에있는 세포에 영양분은 인접 척추 신체에서 모세관 꽃봉오리를 통해 확산에 전적으로 의존하고 있습니다. endplate 표면에 뼈 파편과 응고된 피가의 존재는 디스크와 손상 세포 생존의 중심에 영양 보급을 저해 수 있습니다. 우리 그룹은 오염에 대한 낮은 위험 아웃 꼬리에서 IVDs을 "균열"에 비교적 빠른 프로토콜을 설립했습니다. 우리는 혈전 및 절단 부스러기를 제거하고 매우 효율적으로 영양 보급 경로를 다시 태어난다 수술 제트 세척 시스템을 사용하여 갓 컷 뼈다귀 endplate 표면을 permeabilize 수 있습니다IVD의 중심 있습니다. 척추 뼈 양쪽에 성장 플레이트의 존재는 피할 수 있으며, 문화 이전에 제거할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 준비 중에 중요한 단계를 설명합니다 무료 붓기 문화에 따라 14 일 동안 높은 세포 생존을 유지하는 성공적인 장기 문화의 열쇠를 보여줍니다. 문화 시간은 적절한 기계적 환경 기계 로딩 생물 반응기를 사용하여 유지 수있을 때 확장할 수 있습니다. 기술 여기서 보여주는 등 돼지의, 양의와 토끼 꼬리와 허리 IVD 격리와 같은 다른 동물 종으로 확장될 수 있습니다.
Protocol
Discussion
성공적인 장기 문화에 대한 첫 번째 단계는 explant가 오염해서는 안됩니다 있는지 확인하는 것입니다. 당신이 절차를 시작하기 전에 꼬리는 피부해야합니다. 무균 실험실로 데려 모든 동물의 머리는 오염의 측면에서 문제가 될 수 있습니다. 소 꼬리가 이상 (이것은 초기 세포 생존에 영향을 미치는) 가능한 신선해야합니다. 또한 betadine의 세척 단계는 더욱 오염의 위험을 줄이기 위해 권장합니다. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 스위스 국립 과학 재단 (SNF # 310030-127586/1)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
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