Подготовка интактного говядине Хвост межпозвоночных дисков для органной культуры
Summary
Этот протокол иллюстрирует уборки методика копчикового бычьего межпозвоночных дисков для органа культуры<em> В пробирке</em> Органной культуры.
Abstract
Межпозвонкового диска (IVD) является стык соединения позвоночника позвонка к позвонку. Он функционирует передавать загрузку позвоночника и придаст гибкость позвоночника. Она слагается из трех отсеков: внутренний пульпозного ядра (НП), охватывающий от фиброзного кольца (AF) и два хрящевых концевые соединения Н. П. и А. Ф. в тело позвонка с обеих сторон. Дискогенная боль может быть вызвана дегенеративных заболеваний межпозвоночных дисков (DDD) и дисковые грыжи была определена в качестве одной из основных проблем в нашем современном обществе. Для изучения возможных механизмов IVD дегенерации, в пробирке органной культуры систем с живыми клетками диск очень привлекательным. В пробирке культуру нетронутым бычьего копчикового IVDs зашел настолько далеко, соответствующие модели системы, которая позволяет изучение механо-биологические аспекты в хорошо контролируемых физиологических и механических окружающей среды. Говядина IVDs хвост может быть получен сравнительно легко в большем количествеD очень похожи на человеческие поясничного IVDs по отношению к плотности клеток, клеточной популяции и размеров. Тем не менее, предыдущие бычьей хвостовой IVD методы добычи сохраняя хрящевые и костные концевые концевые удалось через 1-2 дней культуры с питанием пути были явно заблокированы сгустками крови. IVDs являются крупнейшими аваскулярный органов, таким образом, питательные вещества для клеток в НП исключительно зависит от диффузии через капиллярные почек от соседних тел позвонков. Наличие мусора костей и запекшейся крови на концевой пластинки поверхности могут мешать питательных диффузии в центр круга и жизнеспособность компромисс клетки. Наша группа, созданная относительно быстрый протокол для «крэк»-из IVDs из хвоста с низким риском заражения. Мы в состоянии permeabilize свежих вырезать костлявые поверхности концевой пластинки с помощью хирургической системы промывания струей, которая удаляет тромбов и резки мусора и очень эффективно вновь открывается путь питания диффузиик центру IVD. Наличие роста пластин по обе стороны от позвоночного кости, которых следует избегать, и должен быть удален до культуры. В этом видео мы опишем важнейшие шаги в процессе подготовки и демонстрации ключ к успешной органной культуры поддержания высокой жизнеспособности клеток в течение 14 дней в условиях свободного отек культуры. Культуры времени может быть продлен в случае необходимости механической среде может быть обеспечена с помощью механических биореактор нагрузки. Техника показала здесь может быть распространен и на другие виды животных, таких как свиньи, овцы и заячий хвостовой и поясничного IVD изоляции.
Protocol
Discussion
Первым шагом для успешного органной культуры, чтобы убедиться, что эксплантов не должна быть загрязнена. Хвост должен быть кожей, прежде чем начать с процедуры. Любое животное, волосы привести в стерильной лаборатории, может оказаться проблематичным с точки зрения загрязнения. Бычий х?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан Швейцарским национальным научным фондом (ОЯТ # 310030-127586/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack does also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton, England | #10: 0201 #22: 0208 |
|
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 |
|
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen, Switzerland | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, Switzerland | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | TPP, Switzerland | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible | ||
References
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
